ATP结合盒式蛋白转运蛋白在结直肠腺癌中表达及其临床意义

赵炳军 屈 明 张晓丽 张林西

(河北北方学院，河北 张家口 075000)



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ATP结合盒式蛋白转运蛋白在结直肠腺癌中表达及其临床意义

赵炳军 屈 明1张晓丽2张林西2

(河北北方学院，河北 张家口 075000)

目的 探讨多药耐药基因(MDR)1、多药耐药相关蛋白(MRP)1及乳腺癌耐药蛋白(ABCG2)在结直肠腺癌中的表达及其与临床病理特征的关系。方法 采用增强型二步法免疫组织化学方法检测MDR1、MRP1及ABCG2三个基因在116例结直肠腺癌组织中的表达，并分析其可能的临床预后价值。结果 MDR1、MRP1及ABCG2在结直肠腺癌的阳性表达率显著高于切端正常组织(P<0.05)。MDR1、MRP1及ABCG2的表达与病理学分级、淋巴结转移及Duke分期密切相关(P<0.05)，而与年龄、性别及肿瘤发生部位无关(P>0.05)。在结直肠腺癌中MDR1、MRP1及ABCG2的表达呈显著正相关(P<0.05)。结论 结直肠腺癌中存在原发性耐药现象，MDR1、MRP1及ABCG2可能在结直肠癌侵袭转移中存在协同作用。联合检测MDR1、MRP1及ABCG2在结直肠腺癌组织中的表达对化疗药物的选择、化疗方案优化及估计患者预后具有重要指导意义。

ATP结合盒式蛋白(ABC)转运蛋白；结直肠腺癌；多药耐药基因(MDR)1；多药耐药相关蛋白(MRP)1；乳腺癌耐药蛋白(ABCG2)

ATP结合盒式蛋白(ABC)转运蛋白超家族与多药耐药密切相关，部分ABC转运蛋白过表达是肿瘤细胞重要的耐药机制之一〔1〕，而在结直肠癌的相关报道甚少。本研究探讨多药耐药基因(MDR)1、多药耐药相关蛋白(MRP)1、乳腺癌耐药蛋白(ABCG2)这三个具有代表性的ABC转运蛋白在结直肠腺癌的表达水平，并分析其与各临床病理特征的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 河北北方学院附属第一医院2013年1月至2014年6月经手术切除的结直肠腺癌组织116例，年龄40～83岁，平均61.5岁；高分化30例，中分化52例，低分化34例。随机抽取切端正常组织15例。病例均经病理学证实，临床资料完整，患者术前均未进行放化疗。

1.2 主要试剂 即用型鼠抗人单克隆抗体MDR1、MRP1，乙二胺四乙酸(EDTA)抗原修复液(pH8.0)、二氨基联苯胺(DAB)显色剂及增强型二步法(PV6000)检测试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。浓缩型ABCG2鼠抗人单克隆抗体购自武汉博士德生物技术工程有限公司。

1.3 方法 免疫组化增强型两步法(PV6000)检测MDR1、MRP1和ABCG2基因的蛋白表达。蜡块作4 μm厚的连续切片，组织切片常规脱蜡水化，95℃高温EDTA修复抗原，H2O2阻断内源性过氧化物酶，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，分别滴加一抗(ABCG2用抗体稀释液进行1∶100稀释)4℃冰箱过夜，滴加二抗室温孵育30 min，DAB显色5 min，苏木精复染后，脱水透明封片。用已知阳性切片作阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。

1.4 结果判断 MDR1、MRP1、ABCG2蛋白染色结果以胞质和(或)胞膜出现棕黄色染色细胞为阳性细胞。评分标准采用1995年Sinicrope首次应用的由Tanaka于2000年改良的定量计分法〔2〕，选取5个有代表性的不同区域，观察5个400倍视野，计数阳性细胞数，计算阳性细胞百分率和评定显色强度。依照阳性细胞率计分：阳性细胞率≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75为4分；依照显色强度计分：未显色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。两项得分相乘，并取5个高倍视野得分的平均值，得分<2分为阴性，得分≥2分为阳性。

1.5 统计学方法 采用SPSS16.0软件进行χ2检验、Spearman相关分析。

2 结 果

2.1 MDR1、MRP1、ABCG2在结直肠腺癌及切端正常结肠组织中的表达 三者均定位于细胞膜和细胞质，MDR1以细胞膜为主，ABCG2、MRP1以细胞质为主，呈棕黄色颗粒状，弥散分布见图1。三者在结直肠腺癌中的表达显著高于切端正常结肠组织(χ2=16.36、8.31、15.38，P<0.05)。见表1。

图1 高、低分化结直肠癌组织MDR1、MRP1、ABCG2基因蛋白阳性表达(增强型二步法，×200)

组别nMDR1MRP1ABCG2结直肠腺癌11684(72.4)1)82(70.7)1)88(75.9)1)切端正常组织153(20.0)5(33.3)4(26.7)

与切端正常组织相比：1)P<0.05

2.2 MDR1、MRP1 和ABCG2蛋白在结直肠腺癌中的表达与其临床病理特征的关系 MDR1、MRP1和ABCG2蛋白的表达分别为有淋巴结转移组显著高于无淋巴结转移组、Duke分期A+B组显著高于Duke分期C+D组，而高、中分化肿瘤组织显著低于低分化癌组织(均P<0.05)，与患者性别、年龄及肿瘤部位无关(P>0.05)。见表2。

表2 MDR1、MRP1和ABCG2在结直肠癌中阳性表达与其临床病理参数的关系(n)

2.3 MDR1、MRP1和ABCG2在结直肠腺癌表达的相关性 MDR1蛋白与MRP1蛋白阳性表达呈正相关(r=0.196，P<0.05)；MDR1蛋白与ABCG2蛋白阳性表达呈正相关(r=0.463，P<0.05)；ABCG2蛋白与MRP1蛋白阳性表达呈正相关(r=0.345，P<0.05)。

3 讨 论

ABC转运蛋白在结直肠癌临床化疗中发挥着重要作用，其中MDR1、MRP1和ABCG2最具有代表性，与结直肠癌等肿瘤耐药关系密切〔3〕。MDR1介导的多药耐药机制被称为经典机制，MDR1基因编码的糖蛋白相对分子量为170 kD，被命名为P-糖蛋白(P-gp)，是一种具有ATP结合区域的跨膜糖蛋白，能够利用水解ATP获得能量，将进入肿瘤细胞的天然疏水性化疗药物逆浓度梯度泵出细胞外，使化疗药物疗效下降，甚至失效。本实验结果说明MDR1高表达是导致大多数结直肠腺癌存在原发性耐药的原因之一。本研究还发现，在结直肠腺癌浸润进展过程中结果与Ding等〔4〕研究结果相同，并且其实验结果显示MDR1与低氧诱导因子(HIF)-1存在显著共表达。研究〔5〕显示MDR1与突变型P53表达高度相关，提示MDR1可能与结直肠癌的发生、浸润、转移密切相关。本研究在结直肠癌分化方面与魏学明等〔6〕报道一致。也有学者认为MDR1的高表达与结直肠癌的病理分化无关〔7〕，还有学者认为MDR1在中高分化的结直肠癌组织中高于低分化组织〔8〕。这些分歧可能与MDR1基因单核苷酸多态性有关〔9〕。

MRP1与MDR1同属于ABC转运蛋白，在细胞膜和细胞器质膜均有表达，以细胞质为主。与MDR1不同的是，可以将与谷胱甘肽结合的多种抗癌药物转运出细胞，也可以将抗癌药物隔离在高表达MRP1的囊泡内，使抗癌药物不能接近靶点从而耐药。这种耐药具有饱和性，随着谷胱甘肽耗竭化疗药物转运也将停止〔10〕。本实验结果与文献〔11〕报道较相似，MRP1在结直肠腺癌低分化组显著高于中高分化组提示MRP1的高表达可能与结直肠腺癌的原发性耐药产生及浸润进展有关。

ABCG2是近年来发现的一个与多药耐药相关的ABC转运蛋白。ABCG2基因定位于人类染色体4q22上，编码的蛋白质由665个氨基酸构成。它与MDR1和MRP1在结构上有显著的不同，只有一个三磷酸腺苷(ATP)结构域和一个跨膜结构域，所以又被称为半分子转运蛋白，主要转运的底物为亲水或半亲水的分子。在寻找ABCG2的拮抗剂的研究中发现，能够逆转MDR1耐药的传统药物，并不能够逆转ABCG2引起的耐药〔12〕，说明ABCG2与MDR1的耐药机制不尽相同。一项回顾性研究显示高表达ABCG2的转移性结直肠癌对奥沙利铂联合5-氟尿嘧啶(FOLFOX)的治疗反应显著低于ABCG2弱表达者〔13〕。本研究提示ABCG2也参与结直肠癌原发性耐药的产生。在结直肠癌Duke分期和淋巴结转移的对比中，本文结果与梁燕等〔14，15〕研究一致，ABCG2在细胞膜强表达与患者的不良预后显著相关。ABCG2可能在结直肠癌进展过程及耐药产生中发挥重要作用。

本研究说明MDR1、MRP1、ABCG2三者在结直肠腺癌的原发性耐药的产生及浸润、转移存在协同作用。因此，联合检测MDR1、MRP1、ABCG2在结直肠腺癌的表达有助于客观评估患者原发多药耐药状态，以便于选择更敏感的化疗药物，制定更为合理的个体化治疗方案，从而提高化疗效果。

1 Vadlapatla RK，Vadlapudi AD，Pal D，etal.Mechanisms of drug resistance in cancer chemotherapy：coordinated role and regulation of efflux transporters and metabolizing enzymes〔J〕.Curr Pharm Des，2013；19(40)：7126-40.

2 Tanaka K，Iwamoto S，Gon G，etal.Expression of survivin and its relationship to loss of apoptosis in breast carcinomas〔J〕.Clin Cancer Res，2000；6(1)：127-34.

3 张久聪，王彪猛，常宗宏，等.ABC细胞膜转运蛋白及其介导的细胞多药耐药研究进展〔J〕.生物技术通讯，2014；25(6)：862-6.

4 Ding Z，Yang L，Xie X，etal.Expression and significance of hypoxia-inducible factor-1 alpha and MDR1/P-glycoprotein in human colon carcinoma tissue and cells〔J〕.J Cancer Res Clin Oncol，2010；136(11)：1697-707.

5 Zhang Z，Deng X，Ren X，etal.Expression of mutant p53 and of the multidrug resistant proteins P-glycoprotein and glutathione S-transferase-pi correlated in colorectal adenocarcinoma〔J〕.Scand J Gastroenterol，2010；45(7-8)：925-34.

6 魏学明，顾国利，任 力，等.多药耐药基因产物在大肠癌组织中的表达及临床意义〔J〕.世界华人消化杂志，2009；17(24)：2463-8.

7 饶 歆，林从尧，冯茂辉，等.结直肠癌P170蛋白表达的检测及意义〔J〕.武汉大学学报(医学版)，2010；31(1)：58-60.

8 Shi H，Lu D，Shu Y，etal.Expression of multidrug resistance-related proteins p-glycoprotein，glutathione-s-transferases，topoisomerase-Ⅱ and lung resistance protein in primary gastric cardiac adenocarcinoma〔J〕.Hepatogastroenterology，2008;55(86-87)：1530-6.

9 Samanian S，Mahjoubi F，Mahjoubi B，etal.MDR1 gene polymorphisms：possible association with its expression and clinicopathology characteristics in colorectal cancer patients〔J〕.Asian Pac J Cancer Prev，2011；12(11)：3141-5.

10 Chen ZS，Tiwari AK.Multidrug resistance proteins (MRPs/ABCCs) in cancer chemotherapy and genetic diseases〔J〕.FEBS J，2011；278(18)：3226-45.

11 Ji L，Wei Y，Jiang T，etal.Correlation of Nrf2，NQO1，MRP1，cmyc and p53 in colorectal cancer and their relationships to clinicopathologic features and survival〔J〕.Int J Clin Exp Pathol，2014；7(3)：1124-31.

12 Robey RW，Honjo Y，Morisaki K，etal.Mutations at amino-acid 482 in the ABCG2 gene affect substrate and antagonist specificity〔J〕.Br J Cancer，2003；89(10)：1971-8.

13 Lin PC，Lin HH，Lin JK，etal.Expression of ABCG2 associated with tumor response in metastatic colorectal cancer patients receiving first-line FOLFOX therapy-preliminary evidence〔J〕.Int J Biol Markers，2013；28(2)：182-6.

14 梁 燕，王新颖，彭 亮，等.ABCG2在大肠癌中的表达及其对预后的影响〔J〕.现代消化及介入诊疗，2011；16(4)：260-6.

15 Liu HG，Pan YF，You J，etal.Expression of ABCG2 and its significance in colorectal cancer〔J〕.Asian Pac J Cancer Prev，2010；11(4)：845-8.

〔2016-02-17修回〕

(编辑 苑云杰/杜 娟)

河北省高等学校科学技术研究重点项目(No.ZD20131004)

张林西(1968-)，男，博士，教授，硕士生导师，主要从事消化道肿瘤病因及发病机制研究。

赵炳军(1976-)，男，主治医师，硕士，主要从事消化道肿瘤发病机制及临床研究。

R735.3

A

1005-9202(2017)14-3479-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.14.044

1 河北北方学院附属第一医院血管腺体外科

2 河北北方学院生命科学研究中心