药用植物广藿香内生真菌的生物活性研究

马连营 陈玉婵 李浩华 李赛妮 章卫民

广东省微生物研究所，省部共建华南应用微生物国家重点实验室，广东省菌种保藏与应用重点实验室，广东省微生物应用新技术公共实验室，广东 广州 510070



药用植物广藿香内生真菌的生物活性研究

马连营 陈玉婵 李浩华 李赛妮 章卫民*

广东省微生物研究所，省部共建华南应用微生物国家重点实验室，广东省菌种保藏与应用重点实验室，广东省微生物应用新技术公共实验室，广东 广州 510070

目的：研究40株广藿香内生真菌的生物活性，为进一步发掘活性代谢产物提供理论依据。方法：采用SRB、PNPG和DPPH法分别测定内生真菌提取物的细胞毒、抑制α-葡萄糖苷酶和清除DPPH自由基等活性。结果：21株内生真菌对肿瘤细胞SF-268、MCF-7、NCI-H460、HepG-2中的至少3种细胞具有抑制活性，IC50值在0.03～20.30 μg/mL之间，其中菌株A616的抑制活性最为显著，对4种肿瘤细胞的IC50值分别为0.044、0.031、0.030、0.032μg/mL；13株内生真菌具有抑制α-葡萄糖苷酶活性，其中菌株A598的活性最为显著，其IC50值为184.38μg/mL；15株内生真菌具有DPPH自由基清除活性，其中菌株A594、A598、A630显示出较强的DPPH自由基清除能力，IC50值分别为36.33、20.63、59.93 μg/mL。结论：广藿香内生真菌具有多种生物活性，值得进一步深入研究。

广藿香；内生真菌；细胞毒；α-葡萄糖苷酶；DPPH

植物内生真菌生活在植物体内的特殊环境中，与宿主协同进化，形成了互惠共生的关系，能产生与宿主植物相同或相似的代谢产物，且容易从中发现结构新颖并具有多种生物活性的化合物[1]。因此，内生真菌已成为发现新天然活性物质的重要资源之一，在农业和医药工业中具有重要的应用潜力。

广藿香Pogostemoncabin(Blanco)Benth是十大广药之一，主要用于湿浊中阻、胸闷不舒、寒湿闭暑、腹痛吐泻、鼻渊头痛的治疗[2]，其主要化学成分为萜类、黄酮类、生物碱等[3]，具有抗菌、抗肿瘤、抗氧化、杀虫等作用，是《中华人民共和国药典》收载的“藿香正气丸”和“抗病毒口服液”的重要原料，也是鲜藿香露、藿黄散、藿胆丸等30多种中成药的主要组成原料。目前，广藿香的研究主要集中在化学成分和药理活性方面，但对其内生真菌的研究鲜有报道。本课题组前期对广藿香内生真菌进行了分离鉴定、类群分析和抗菌活性研究，发现广藿香内生真菌多样性丰富，部分菌株提取物具有明显的抑菌活性[4]，说明广藿香内生真菌具有重要的研究开发价值。为了充分发掘广藿香植物中具有重要生物活性的内生真菌资源，笔者进一步对其内生真菌进行了细胞毒、抑制α-葡萄糖苷酶和清除DPPH自由基等活性研究，从中发掘出活性菌株，为今后研究广藿香内生真菌的活性代谢产物提供理论依据。

1 材料与仪器

1.1 材料

1.1.1 供试菌株40株内生真菌从采自广东省阳春市马水镇的广藿香植物中分离获得[4]。详见表1。所有菌株保存于广东省微生物研究所。

表1 40株广藿香内生真菌菌株

1.1.2 供试肿瘤细胞株神经胶质瘤细胞SF-268、乳腺癌细胞MCF-7、大细胞肺癌细胞NCI-H460、人肝癌细胞HepG-2。以上肿瘤细胞株均保存于广东省微生物研究所。

1.2 试剂 RPMI1640基础培养基、胎牛血清、双抗(10000U/mL青霉素+10000U/mL链霉素)均购自Gibco公司；磺酰罗丹明B(SRB)、二甲基亚砜(DMSO)、α-葡萄糖苷酶、对硝基苯-硝基葡萄糖苷(PNPG)、维生素C、2,2-二苯基-1-苦肼基(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH)，均购自Sigma公司；顺铂(齐鲁制药有限公司)；阿卡波糖(中国药品生物制品检定所)；其它试剂均为分析纯，购自广州化学试剂厂。

1.3 主要仪器 2123-2二氧化碳培养箱(Shellab公司)；DMI3000B倒置显微镜(Leica公司)；RE-2000型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；超净工作台(上海恒益科技有限公司)；Multiskan酶标仪(Thermo公司)。

1.4 培养基 马铃薯葡萄糖培养基(PDA)：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，KH2PO43g，MgSO41.5g，维生素B 10mg，蒸馏水1L，pH自然；RMPI 1640完全培养基：RPMI1640基础培养基1L，胎牛血清0.1L，双抗0.01L，混合均匀，4℃冰箱保存。

2 方法

2.1 内生真菌的液体培养及其提取物的制备 挑取经活化的内生真菌菌丝体接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中，28℃、120r/min摇床培养7d，过滤，收集发酵液并用乙酸乙酯萃取3次，萃取液于旋转蒸发仪浓缩至干，得提取物浸膏。将提取物浸膏用DMSO溶解配制成50mg/mL浓度，备用。

2.2 内生真菌提取物的活性测定

2.2.1 细胞毒活性测定 采用SRB[5]法，将内生真菌提取液和顺铂用1640培养基稀释至所需的浓度。取对数生长期的肿瘤细胞株SF-268、MCF-7、NCI-H460、HepG-2，用胰酶消化，台盼蓝染色计数，台盼蓝排斥实验检测细胞活力大于95%后，用1640培养基调整细胞浓度为3×104个/mL，细胞接种于96孔板，每孔加入180μL的细胞悬液，并设3个空白孔调零，于37℃、5%CO2培养箱培养24h。待细胞贴壁后，每孔加入20μL提取物稀释液，阴性对照加20μL培养基，以顺铂作阳性对照。置CO2培养箱中培养72h后，加入50μL 50%冷三氯醋酸固定细胞，4℃放置1h后用蒸馏水洗涤5次，空气中自然干燥。然后每孔加入4mg/mL SRB 溶液100μL，室温中染色30min，去上清，用1%冰醋酸洗涤5次。最后加入每孔10mmol/mL的Tris溶液200μL，用酶标仪测定570nm处的吸光值(A)，用以下公式计算提取物对细胞生长的抑制率，采用SigmaPolot 10.0 软件计算对肿瘤细胞的IC50值。

细胞生长抑制率(%)=(1-A样品组/A对照组)×100%

2.2.2 α-葡萄糖苷酶抑制活性测定 参照杨付梅[6]和《药理实验方法学》[7]：将内生真菌提取液和阿卡波糖用PH 7.0的0.1mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)稀释至所需的浓度，α-葡萄糖苷酶冻干粉配成浓度为0.2 U/mL溶液，底物(PNPG)配成浓度为10mmol/L溶液。吸取提取10μL于96孔板中，加入α-葡萄糖苷酶溶液20μL和50μL PBS作样品组，以PBS作参比溶液(空白对照组)，以PBS代替PNPG溶液作样品背景组，以PBS代替提取物溶液作阴性对照组，以阿卡波糖作阳性对照组，37℃孵育10min，然后加入20μL PNPG，37℃反应15min，加入3%SDS终止反应，405nm处测定吸光度值(A)，采用SigmaPolot 10.0软件计算对α-葡萄糖苷酶抑制的IC50值。

抑制率(%)= [1-(A样品组-A样品背景组)/(A阴性对照组-A空白对组照)]×100%

2.2.3 DPPH自由基清除活性测定 参照Turkoglu等[8]方法：将内生真菌提取液和维生素C用无水乙醇稀释成浓度为10mg/mL溶液，DPPH配制成0.2mmol/L溶液。吸取提取稀释液100μL于96孔板中，加入浓度为0.2mmol/L的DPPH溶液100μL作样品组，以无水乙醇溶液作参比溶液(空白对照组)，以无水乙醇代替DPPH溶液作样品背景组，以无水乙醇代替提取物溶液作阴性对照组，以维生素C溶液代替提取物溶液作阳性对照组。置30℃培养箱中反应30min，用酶标仪测定每孔517nm处的吸光值(A)，按以下公式计算提取物对DPPH自由基的抑制率，采用SigmaPolot 10.0软件计算对DPPH自由基清除的IC50值。

清除率(%)=[1-(A样品组-阳性组-A背景组)/(A阴性组-A空白对照组)]×100%

3 结果

3.1 细胞毒活性 采用SRB法测定40株广藿香内生真菌发酵提取物对4种肿瘤细胞株的细胞毒活性，结果发现有33株真菌提取物至少对1种供试肿瘤细胞有抑制作用(抑制率≥50%)，对3种肿瘤细胞有抑制作用(抑制率≥50%)的活性菌株有21株，对4种肿瘤细胞均有抑制作用(抑制率≥50%)的活性菌株有19株；分别对SF-268、MCF-7、NCI-H460、HepG-2有抑制作用(抑制率≥50%)的菌株分别有26、22、9、21株，其中至少对1种肿瘤细胞具有显著抑制活性(抑制率≥90%)的菌株有6株；有8株菌株对SF-268、MCF-7、NCI-H460、HepG-2细胞的IC50值在0.03～20.30μg/mL之间，菌株A625和A658对以上4种细胞株的IC50值分别是2.19、1.31、9.67、2.76和1.81、3.99、1.85、8.79μg/mL，接近阳性对照药物顺铂的IC50值，表明这2株菌株的细胞毒活性与顺铂相当；菌株A616对细胞毒活性尤为显著，对4种肿瘤细胞的IC50值分别是0.044、0.031、0.030、0.032 μg/mL，低于阳性对照药物顺铂的IC50值，细胞毒活性优于顺铂(表2、表3)。

表2 广藿香内生真菌提取物对肿瘤细胞的抑制作用(n=3)

注：提取物的作用浓度为100μg/mL。

表3 广藿香内生真菌提取物对肿瘤细胞的IC50值

3.2 α-葡萄糖苷酶抑制活性 通过α-葡萄糖苷酶抑制活性测试，结果发现有13株内生真菌提取物对α-葡萄糖苷酶具有抑制作用，抑制率均在50%以上；抑制率在90%以上有5株，其中菌株A593、A630、A646、A651对α-葡萄糖苷酶的IC50值分别为440.63、443.75、403.16、426.56μg/mL，抑制效果接近阳性对照药物阿卡波糖，菌株A598表现出显著的抑制效果，IC50值为184.38μg/mL，优于阿卡波糖。详见表4、5。

表4 广藿香内生真菌提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用 (n=3)

注：提取物的作用浓度为1000μg/mL。

表5 广藿香内生真菌提取物对α-葡萄糖苷酶IC50值 (n=3)

3.3 DPPH自由基清除活性 通过DPPH自由基清除活性测定，结果发现有15株内生真菌提取物对DPPH自由基的清除率均在50%以上，其中9株清除率在90%以上，菌株A594、A598、A630显示出较强的清除效果，IC50值分别为36.33、20.63、59.93μg/mL。详见表6、7。

表6 广藿香内生真菌提取物对DPPH自由基的清除率

注：提取物的作用浓度为1000μg/mL。

表7 广藿香内生真菌提取物对DPPH自由基的IC50值 (x±s,n=3)

4 小结

笔者对40株分离自广藿香植物的内生真菌进行了细胞毒、抑制α-葡萄糖苷酶和DPPH自由基清除等活性筛选，从中发现了21株内生真菌至少对供试的3种肿瘤细胞有明显的抑制活性；13株具有抑制α-葡萄糖苷酶活性；15株具有清除DPPH自由基活性。菌株A625和A658对肿瘤细胞的抑制活性接近阳性药物顺铂，菌株A616对肿瘤细胞的抑制活性优于顺铂；菌株A598对α-葡萄糖苷酶的抑制效果优于阳性药物阿卡波糖；菌株A594、A598、A630显示出较强的DPPH自由基清除能力，IC50值均≤60μg/mL。研究结果表明，广藿香内生真菌具有多种生物活性，具有重要的研究价值。

本研究通过活性测试从广藿香内生真菌中筛选获得了多株具有细胞毒、抑制α-葡萄糖苷酶和清除DPPH自由基等生物活性的菌株，为后续深入发掘广藿香内生真菌活性代谢产物提供了理论依据。

[1]施琦渊, 陈晓梅, 郭顺星.植物内生真菌来源的抗菌活性物质研究进展[J].中国药学杂志, 2007,42(11):804-807.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京：中国医药科技出版社, 2015: 45.

[3]黄烈军.中药广藿香化学及生物活性成分研究[D].贵阳：贵州大学, 2008.

[4]王营, 李浩华, 谭国慧, 等.广藿香内生真菌类群分析及其抗菌活性研究[J].中国中药杂志,2017,42(4): 657-662.

[5]Skehan P,Storeng R,Scudiero D,et al.New colorimetric cytotoxicity assay for anticancer-drug screening[J].J Nat Cancer Inst,1990,82(13):1107-1112.

[6]杨付梅,孙黔云.α-葡萄糖苷酶抑制剂微量筛选模型的正交法构建和筛选[J].中国药理学通报,2009,25(8):1113-1116.

[7]刘建文.药理实验方法学: 新技术与新方法[M].2版.北京: 化学工业出版社,2008：254.

[8]TurkogluA,DurnME,MercanN,et al.Antioxidant and antimicrobial activities of Laetiporussulphreus(Bull.) Murrill[J].Food Chem,2007(101):267-273.

Study on Biological Activities of Endophytic Fungi FromPogostemoncabin

MA Lianying CHEN Yuchan LI Haohua LI Saini ZHANG Weimin*

State Key Laboratory of Applied Microbiology Southern China, Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application, Guangdong Open Laboratory of Applied Microbiology, Guangdong Institute of Microbiology, Guang zhou 510070, China

Objective To investigate biological activities of 40 endophytic fungal strains derived fromPogostemoncabin, thus providing a theoretical basis for further searchfor biologically activemetabolites.Methods Cytotoxic, α-glucosidaseinhibitoryand DPPH free radical scavenging activities of endophytic fungal extractswere examined by the SRB,PNPG and DPPHmethods, respectively.Results 21 strains showed inhibitory activity against at least three tumor cell lines of SF-268, MCF-7, NCI-H460 and HepG-2 with IC50values ranging from 0.03 to 20.30 μg/mL.Among them, the strain A616 exhibited the strongest cytotoxicity against the four tumor cell lines with IC50values of 0.044, 0.031, 0.030 and 0.032 μg/mL, respectively.13 strains showed α-glucosidaseinhibitory activity, among which the strain A598 displayed the strongest inhibitory activity with an IC50of 184.38μg/mL.15 strains showed DPPH free radical scavenging activity, and among them the strains A594, A598 and A630 exhibited the stronger free radical scavenging capacity with IC50of 36.33, 20.63 and 59.93 μg/mL, respectively.Conclusion Endophytic fungi derived fromP.cabinshowed several biological activities and deserved further study.

PogostemonCabin; Endophytic Fungus; Cytotoxic; α-glucosidase; DPPH

国家973前期专项(2014CB460613)；广东省科技计划项目(2015A030302060，2014A030304050)；广东省自然科学基金项目(2015A030313710)。

马连营(1973-)，男，汉族，本科，高级工程师，研究方向为微生物资源与应用。E-mail: mly@gdim.cn

章卫民(1965-)，男，汉族，博士，研究员，研究方向为药用微生物资源及其活性物质研究。 E-mail: wmzhang58@qq.com

R285.5

A

1007-8517(2017)13-0028-05

2017-05-04 编辑：穆丽华)