HPLC法同时测定护肝宁片中5种活性成分的含量

初丕江 罗廷顺* 王 姣

1.大理州食品药品检验所，云南 大理 671000；2.大理大学，云南 大理 671000



药物研究

HPLC法同时测定护肝宁片中5种活性成分的含量

初丕江1罗廷顺1*王 姣2

1.大理州食品药品检验所，云南 大理 671000；2.大理大学，云南 大理 671000

目的：建立同时测定护肝宁片中虎杖苷、槲皮素、大黄素、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA 等5种活性成分含量的HPLC法。方法：采用Waters Symmetry®C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为乙腈-0.1%的磷酸水溶液梯度洗脱，检测波长为270nm，柱温为40℃，流速为1.0mL/min。结果：5种成分的标准曲线线性关系良好(r≥0.9996，n=6)，虎杖苷、槲皮素、大黄素、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA的平均加样回收率均在92.6%～95.7%之间，RSD均在1.3～2.1%(n=9)之间。结论：该方法准确，灵敏，精密度好，重现性高，适用于护肝宁片中这5种活性成分含量的测定。

护肝宁片；高效液相色谱；含量测定；活性成分

护肝宁片是一种主要用于治疗急慢性肝炎的中药复方制剂，由垂盆草、虎杖、丹参、灵芝组成，具有清热利湿退黄、疏肝化瘀止痛等功效，现代临床常用于治疗湿热中阻、淤血阻络所致脘腹胀痛、口苦、黄疸、胸闷、纳呆以及急慢性肝炎[1]。槲皮素为垂盆草药材的主要成分[2-3]，能改善患者恶心、纳呆、上腹饱胀、乏力等症状，同时能保护肝脏，治疗肝脏炎症，其疗效持久，且无明显毒副作用[4]；虎杖苷和大黄素为虎杖药材的主要成分，大黄素成分能显助改善肝病变患者的病情，虎杖苷成分具有镇咳，去痰、平喘、抗菌、清除自由基、调血脂、降低胆固醇之功效，可达到保护肝脏的作用[5]；丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA为丹参药材的主要成分[6]，丹参中的丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA具有改善微物质循环、疏通肝内血液瘀滞、降低肝细胞纤维化程度、清除细胞内氧自由基、保护肝细胞等药理作用[7]。黄丽华等[8]通过HPLC法测定护肝宁片中的大黄素，崔桂英[9]主要采用HPLC法测定护肝宁片中的丹参酮，陈波等[10]通HPLC法测定护肝宁片中的虎杖苷成分，马果玉等[11]通过TLC定性鉴别丹参和虎杖，运用HPLC定量分析虎杖中的虎杖苷成分。目前对处方中多指标成分的同时定量分析研究甚少，且2015年版药典[ 1]也仅针对处方中的某一指标成分进行含量测定，对多指标成分并未建立统一的定量分析方法。因此，本文旨在建立护肝宁片中多指标成分的HPLC定量分析方法，提高护肝宁片的用药安全性，为护肝宁片的质量控制提供一定的参考依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 LC-20 AT 型高效液相色谱仪(日本岛津制作所)；AND GH-252电子天平(日本A&D公司)；SB-5200型双频超声仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)；UV-2550型紫外分光光度仪(日本岛津苏州仪器有限公司)。

1.2 材料 虎杖苷(批号：111575-200502)、丹参酮ⅡA(批号：110766-200518)、丹参酮Ⅰ(批号：0867-200205)、大黄素(批号：110758-200110)、槲皮素(批号：100081-200907，96.5%)等均购自中国食品药品研究院。护肝宁片(批号:20150902、20160802，贵州信邦制药股份有限公司；批号：20150101，吉林百姓堂药业有限公司)，乙腈(色谱纯，批号：16065117，国药集团化学试剂有限公司)、甲醇(分析纯，批号：10014118，国药集团化学试剂有限公司)，乙醇(分析纯，批号：20160503，国药集团化学试剂有限公司)，磷酸为优级纯，水为超纯水。

2 方法

2.1 色谱条件 采用Waters C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相A为乙腈，流动相B为0.1%的磷酸水溶液，进行梯度洗脱，洗脱程序如表1。检测波长270nm，柱温40℃，进样量10μL，流速为1.0mL。

表1 梯度洗脱程序

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品储备溶液的制备 精密称取虎杖苷对照品13.72mg，大黄素对照品11.93mg，丹酚酸ⅡA对照品5.42mg，丹参酮Ⅰ对照品10.43mg，槲皮素对照品(含量：96.5%)21.56mg置于同一10mL容量瓶中加甲醇适量，超声(功率250W，频率40kHz)使溶解，加甲醇至刻度，制成混合对照品储备溶液。

2.2.2 混合对照品溶液的制备 精密移取混合对照品储备溶液1mL至25mL容量瓶中，加甲醇稀释至既定刻度，制成含虎杖苷、大黄素、丹酚酸ⅡA、丹参酮Ⅰ、槲皮素对照品分别为54.88、47.72、21.68、41.72、83.22μg·mL-1的混合对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 护肝宁片(薄膜衣片)：取护肝宁片20片，研细，精密称取0.5g于200mL容量瓶中，加75%乙醇适量，超声(功率250W，频率40kHz)提取30min，冷却，摇匀，滤过，作为供试品溶液待测；护肝宁片(糖衣片)，取护肝宁片10片，去除包衣，研细，精密称取0.5g于25mL容量瓶中加75%乙醇适量，超声(功率250W，频率40kHz)提取30min，再加75%乙醇至刻度，摇匀，滤过，作为供试品溶液，待测。

2.2.4 阴性样品溶液的制备 去除垂盆草、虎杖、丹参、灵芝，按处方比例和制备工艺制备阴性样品，按“2.2.3”项下方法制备阴性样品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 系统适用性试验及专属性考察 分别精密吸取“2.2.2”、“2.2.3”、“2.2.4”项下溶液，按“2.1”项下方法进行分析，记录色谱图，结果见图1。由图1可见，在该色谱条件下，虎杖苷、槲皮素、大黄素、丹参酮Ⅰ、丹酚酸ⅡA 与其它相邻成分分离度均大于1.5，理论塔板数均大于10200，表明该方法专属性良好。

2.3.2 线性关系考察 分别精密移取上述混合对照品溶液10.0、2.5、5.0、5.0、2.0、2.0mL分别置10、20、25、50、100、200mL容量瓶中，加甲醇稀释制成混合对照品系列浓度溶液，同时阴性样品溶液和供试品溶液均按照“2.1”项下色谱条件进样测定。结果见图1。以峰面积(y)为纵坐标，浓度(x，μg)为横坐标，进行线性回归，得到虎杖苷、槲皮素、大黄素、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA的回归方程。结果表明，这5种成分的线性关系良好。结果见表2。

2.3.3 定量限与检测限 精密移取“2.2.1”项下混合对照品储备溶液2.0mL置于200mL量瓶中，加甲醇稀释成一定浓度的对照品溶液，按“2.1”项下色谱方法分析。得信噪比为3和10时分别为虎杖苷、槲皮素、大黄素、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA5种成分的检测限与定量限。结果见表2。

表2 护肝宁片中5种成分的线性关系、检出限和定量限

2.3.4 精密度试验 精密吸取上述混合对照品10μL，按“2.1”项下色谱条件分析，分别连续进样6次，考察5种成分各色谱峰的保留时间和峰面积的一致性，结果各色谱峰的保留时间的RSD为0.3%～1.2%，峰面积RSD为0.5%～2.1%。结果表明仪器精密度良好。

2.3.5 重复性试验 精密称取同一批号护肝宁片(贵州信邦制药股份有限公司，批号:20160802)0.5g，共6份，按照“2.2.3”项下供试品溶液制备方法制备，按照“2.1”项下分析条件分析，以外标法计算含量，结果虎杖苷、槲皮素、大黄素、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA 5种成分的平均含量分别为 12.97、23.37、0.9011、0.4047、0.08857mg/g，RSD分别为0.8%、1.1%、1.5%、1.1%、0.9%(n=6)。表明方法重复性良好，符合要求。

2.3.6 稳定性试验 精密称取同一批号护肝宁片(贵州信邦制药股份有限公司，批号:20160802)0.5g，按照“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、16、32、48h时按照“2.1”项下分析条件测定5种成分的峰面积，结果虎杖苷、槲皮素、大黄素、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA 5种成分的峰面积的RSD分别为0.3%、1.0%、0.5%、0.7%、1.1%(n=7)。表明供试品溶液在48h内稳定性良好。

2.3.7 加样回收率试验 精密称取已知含量(虎杖苷12.97mg/g、槲皮素23.38mg/g、大黄素0.9072mg/g、丹参酮Ⅰ0.4039mg/g、丹参酮ⅡA 0.08871mg/g)的护肝宁片(批号:20160802)0.25g，共9份，平均分为3组。分别精密加入3、2、1mL混合对照溶液(虎杖苷0.205mg/mL、大黄素0.0198mg/mL、丹参酮ⅡA 0.00202mg/mL、丹参酮Ⅰ0.00872mg/mL、槲皮素0.390mg/mL)。按“2.2.3”项下方法平行制备样品溶液，按照 “2.1”项下分析方法进行测定，以外标法计算含量，并计算回收率。结果见表3。

表3 加样回收试验结果 (n=9)

续表3 表3 加样回收试验结果 (n=9)

2.3.8 含量测定 精密称定护肝宁片0.5g，平行3份，按照“2.2.3”项下方法制备样品溶液，然后按照“2.1”项下色谱条件进行测定，所得样品含量见表4。

表4 样品含量测定结果 (mg/g，n=3)

3 讨论

供试品提取条件的优化。主要考察提取溶剂和提取时间对提取效率的影响，分别考察了50%、90%、100%甲醇，50%、75%、95%乙醇6种提取溶剂，还考察了超声(功率250W，频率40kHz)提取的时间(20、30、40min)。最终得出护肝宁片最佳提取溶剂为75%乙醇溶液，超声(功率250W，频率40kHz)提取30min。

检测波长的选择。取稀释至一定浓度混合对照品溶液，在紫外波长为200～400nm范围下扫描。测得虎杖苷在216.5、306nm波长处有最大吸收，大黄素在217.5、253.5、290nm波长处有最大吸收，槲皮素在255.5、371.5nm波长处有最大吸收，丹参酮Ⅰ在244nm波长处有最大吸收，丹参酮ⅡA在219.5、267.5nm波长处有最大吸收。综合考虑兼顾每个化合物，最终选定HPLC检测波长为270nm。

通过查阅文献发现，目前对护肝宁片中指标成分的含量测定研究甚少，且大多仅针对其中的某一指标成分进行研究[12-17]。本文主要选择护肝宁片中的5种成分(虎杖苷、大黄素、槲皮素、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA)为指标成分，在前人研究的基础上，建立统一的HPLC含量测定方法。5种成分在相应的响应值范围内线性关系良好，r值均大于0.9996，平均加样回收率为92.6%～95.7%，RSD为1.3%～2.1%。该方法精密度好、重现性高，适用于同时测定护肝宁片中这5种成分的含量，为护肝宁片的质量控制提供一定的参考依据。

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Simultaneous Determination of 5 Active Compositions in Huganning Tablets by HPLC

CHU Pijiang1LUO Tingshun1*WANG Jiao2

1.Dali Institute For Food and Drug Control，Dali 671000，China;2.College of Pharmacy and Chemistry，Dali University，Dali 671000，China；

Objective To establish a HPLC method for the simultaneous determination of Polydatin, quercetin, emodin, TanshinoneⅠ, TanshinoneⅡA in Huganning tablets.Methods The HPLC method uses the waters Symmetry®C18chromatographic column (250mm×4.6mm,5μm), with the mobile phases were acetonitrile -0.1% phosphoric acid aqueous solution with gradient elution at a flow rate of 1.0mL·min-1.The detection wavelength was 270nm, the column temperature was 40℃.Results The calibration curves of five active compositions showed good linear relationship (r≥0.9996,n=6), the average recovery of Polydatin, quercetin, emodin, TanshinoneⅠ, TanshinoneⅡA five active compositions was within the range of 92.6%～95.7%，theRSDwithin the range of 1.3%～ 2.1%(n=9).Conclusion The method is sensitive and accurate with good reproducibility,and precision, which can be used to simultaneous detection the five active components in Huganning tablets.

Huganning Tablets；HPLC；Content Determination；Active Compositions

初丕江(1976 -)，女，白族，本科，副主任药师，研究方向为药品检验检测及方法学。 E-mail: 747183552@qq.com

罗廷顺(1985-)，男，汉族，硕士，主管药师，研究方向药品检验检测及方法学。E-mail：309632602@qq.com

R284

A

1007-8517(2017)13-0008-05

2017-04-30 编辑：穆丽华)