包虫病血清学检测方法及其诊断意义

黄燕+尚婧晔+陈凡+何伟+张光葭+喻文杰+王奇+廖沙+李汭芮+王谦

近来，卫生部门和畜牧部门针对包虫病开展了一系列的联合防控工作，极大地促进了包虫病的防控进程，提高了包虫病的防控效率，达到了包虫病防控的工作预期。本文对包虫病的血清学诊断常用的一些抗原和血清学诊断方法进行简要介绍，阐述了血清学结果在人群包虫病诊断中的意义。

1包虫病的诊断标准

我国主要存在囊型包虫病（CE）和泡型包虫病（AE）。包虫病的诊断需要从以下几个方面进：①患者要有流行病学接触史；②患者有无相关临床症状；③患者有影像学占位性病变或包虫病特征性影像；④实验室检查患者包虫病血清学抗体阳性或病原学检查发现特征性的结构或特异性核酸检测为阳性。只有通过这几方面的特征进行综合判断，才能作出正确的诊断结果。

2包虫病血清学诊断的常用抗原

包虫病的血清学诊断是人包虫病诊断的依据之一，包虫病的血清学诊断常用到一些抗原，有天然抗原和重组抗原。

2.1细粒棘球蚴天然抗原（Eg抗原）

2.1.1粗抗原棘球蚴的包囊液、原头节和囊壁组织都曾用作诊断试验的抗原，但包囊液被认为是诊断抗原的最好来源。

2.1.2抗原5/弧5（Ag5）抗原典型的弧5抗原是在囊型包虫病里发现的。Carpron等用囊液抗原和棘球蚴患者血清进行免疫电泳（IEP）试验，将IEP中出现的一条沉淀线称为弧5。用亲和层析的方法，从浓缩的包囊液中得到纯化的“弧5”抗原。这种抗原在电泳中只产生单一的沉淀线，为一种脂蛋白，分子量为60 kDa，不耐热，加热70℃抗原即失活。棘球蚴患者血清经常出现弧5沉淀线，在其他病人中未发现弧5抗原。

2.1.3抗原B（AgB）AgB也是常用的囊型包虫病诊断抗原。Oriol等将浓缩的包囊液经处理得到纯化抗原，与免疫血清做IEP可出现两条沉淀线，命名为抗原A和抗原B。2种抗原都是脂蛋白，将抗原煮沸15 min后，A成分丧失。根据抗原A的IEP沉淀线特征，可以认为与Carpron等的抗原5是同一种抗原组分。而抗原B加热后无变化，为一种耐热抗原，分子量约为16 kDa。

大量研究和临床检测证明：抗原5和抗原B的亚基对囊型包虫病（Eg）都不是特异性的，在泡型包虫病（AE）、伏氏棘球蚴或CE患者血清中均可测出特异性抗体。在猪带绦虫和猪囊尾蚴感染患者血清中也能测出高水平的抗Ag5抗体，这两种抗原和猪囊虫病交叉感染很高，有的甚至可以达到20%～30%，这是包虫病血清学检测中出现交叉反应的主要原因之一。

2.1.4P-29抗原Gonzalez等用Eg原头节抗原单克隆抗体鉴定出一个抗原组分P-29。在免疫印迹实验中，单抗仅识别原头节粗抗原约29 kDa的一条带。免疫组化研究显示，P-29定位于包囊生发层和原头节的表皮层、顶突和吸盘，在包囊液和成虫提取物中都没有P-29。

2.1.5P1血型抗原包虫囊液抗原和囊壁提取物中有一种成份，其抗原的活性与人红细胞的P1抗原相似，叫做红细胞P1抗原。红细胞P1的成分是糖脂，包囊液P1的活性物质则为糖蛋白。科研人员在研究肥头绦虫（Taenia crassiecps）、牛带绦虫（T. saginata）、猪带绦虫（T. solium）的化学和免疫学染色图谱时发现几种绦虫的糖脂相同，在结构上与P1相似并具有P1活性，所以，包虫病和这些绦虫感染也会出现交叉反应。检测时注意分离血清的过程中一定不要让红细胞破裂。如果红细胞破裂，红细胞表面的P1抗原可能会进入到血清里，血清学检测会出现假阳性。因为那只是红细胞膜上的抗原，而不是真正的来自蟲体的抗原，所以会出现一个很典型的假阳性反应。

2.2多房棘球蚴天然抗原（Em抗原）

2.2.1粗抗原对多房棘球蚴的免疫学诊断研究最初也是从粗抗原开始的。多房棘球蚴的组织结构与囊型棘球蚴不同，不能像囊型包虫病那样方便地获取可溶性包囊液抗原材料。Em粗抗原多来自虫体的全组织匀浆抽提物或原头节组织抗原。ELISA试验显示粗抗原与CE血清呈现广泛的交叉反应。

2.2.2Em2抗原Gottstein等获得了一个组分分子量约为54kDa，等电点为4.8，称为Em2抗原。Em2抗原对AE血清敏感性达94%，与其他异源性蠕虫感染血清无交叉反应，但与CE血清有反应，只是抗体滴度较低。用FITC（异硫酸酯荧光素）标记可特异性识别Em抗原的单抗MabG11，直接荧光法检测显示，MabG11定位于角质层和体外培养13天的六钩蚴。生发层组织、原头节、成虫及新鲜孵出的六钩蚴均无Em2抗原。因而认为Em2具有阶段特异性。Em2抗原主要定位于角质层组织，这较好地解释了在Em感染甚至在自愈患者血清中抗体长期存在，而在手术完全切除病灶的患者血清中抗体迅速下降的原因。

2.2.3Em18和Em16抗原Ito用免疫印迹法从Em原头节组织抗原中鉴定出两种抗原组分，分子量约为18 kDa和16 kDa，分别命名为Em18和Em16。Em16抗原识别AE血清敏感性低、特异性差。报告称Em18抗原具有较好的特异性和敏感性，Em18还能区别活动性和非活动性病灶。由于Em18在Eg原头节抗原组分中也存在，所以Em18并非种特异性抗原，但仍可作为鉴别诊断用抗原（AE病人血清抗体滴度高于CE病人）。人体感染泡型包虫病后，病灶中基本没有原头蚴（图1）或者原头蚴非常少，因此用原头蚴的指标来判定人的包虫病的活跃程度，还有待于商榷。

2.2.4糖脂抗原Persat和Dennis等相继从Em和Eg续绦期组织中分离出寄生虫特异的中性和酸性糖脂。用AE患者血清检测从Em提取的糖脂，发现与血清中抗体结合的是特异性的中性糖脂，酸性糖脂无反应。CE血清对酸性糖脂反应能获得高OD值，这一结果表明糖脂组分抗原有可能对AE、CE及其它蠕虫病作鉴别诊断。endprint

3包虫病血清学诊断的常用重组抗原及合成多肽

3.1细粒棘球蚴重组抗原

3.1.1Ag5表位特异性相关基因的克隆Facon等从Eg原头节cDNA文库中筛选出一个阳性克隆Eg6，含有456bp核苷酸，编码了152个氨基酸。其融合蛋白可被Ag5的一株单抗特异性识别，又用该单抗从Eg原头节cDNA文库中筛选出一个阳性克隆Eg14，其编码的氨基酸序列与Eg6部分相同。

3.1.2抗原B表位特异性相关基因的克隆Shepherd用羊包囊液抗原的兔免疫血清从Eg原头节cDNA文库筛选到一个克隆，为AgB 12kDa亚单位C末端的一个片段。Helbig等用混合患者血清从Eg幼虫cDNA表达库中获得一个阳性克隆Eg55。对克隆 Eg55测序显示与上述的C-末端片段核苷酸序列有94.3%的同源性。

3.2多房棘球蚴重组抗原

3.2.1Ⅱ/3和Ⅱ/3-10抗原Vogel等用患者血清从Em cDNA文库筛选出克隆Ⅱ/3。表达的融合蛋白在细胞内被迅速降解为31和33kDa两个多肽，这两个多肽与患者血清中特异性抗体有很好的结合能力。Muller等将Ⅱ/3抗原切割成片段进行亚克隆，克隆Ⅱ/3-10表达的β-半乳糖甘酶融合蛋白，对AE血清敏感性为90%，特异性为99%。

3.2.2EM2、EM4和EM10抗原Hemmings等用两型棘球蚴感染血清从Em原头节cDNA文库中筛选出克隆EM4。用ELISA检测AE患者血清特异性为100%。Frosch等构建了一个Em原头节cDNA表达文库，并用AE混合血清筛选获得5个阳性克隆，部分序列比较证实均为同一基因称EM10。免疫荧光显示这种基因表达的抗原位于Em原头节皮层和育囊的生发层。对Ⅱ/3、EM4和EM10的DNA序列比较结果，证实它们是相同的或非常相似的抗原。

3.2.3RecEm18Sako等研究了Em18与Em 65kDa抗原的关系，65 kDa被确定为EM10或Ⅱ/3的编码蛋白。对天然Em18抗原的N-末端进行测序，发现Em18也是EM10抗原的一个片段。Sako等成功地用大肠杆菌表达系统表达了重组Em18抗原，命名为RecEm18。用ELISA检测血清结果显示，RecEm18可识别90.3%的经临床或病理证实的AE血清样本。

3.3包虫病常见的血清学诊断方法

包虫病的常见血清学诊断方法包括：补体结合试验（CF）、间接凝集试验（IHA和LA）、间接抗体标记试验（ELISA、IFA和RIA）、沉淀试验（IEP、DD5、CIEP和IED）、免疫印迹试验（Immunoblot）、金标免疫渗滤法（DIGFA）、胶体金免疫层析试条（GICTS）等。3.3.1抗体IgG检测在棘球蚴病患者血清中含量最多的特异性抗体是IgG，目前多用检测血清中的IgG，作为包虫病免疫学诊断的主要指标。常用方法有间接ELISA、IHA、Immunoblot、DIGFA和GICTS等。

间接ELISA：是目前运用最广泛的检测手段。检测的特异性和敏感性随不同厂商生产的试剂质量不同而存在差异。检测中需要用到酶标仪、洗板机和孵化箱等设备，因此必须在实验室操作，采样现场不能直接出结果。

间接血凝：将囊液抗原致敏醛化的绵羊红细胞，在倍比稀释的待检血清反应孔中加入致敏的红细胞悬液，孵化2～3h后观察红细胞凝集反应，以血清一定比例稀释出现凝集反应者判为包虫血清抗体阳性。肉眼判断的结果存在一定人为因素的干扰。

免疫印迹：先将抗原进行电泳后转移至硝酸纤维膜上，做成抗原膜条，在待检血清中加入抗原膜条，反应后出现特异条带，如12KD、17KD、18KD、24KD等。

金标免疫渗滤法和胶体金免疫层析试条：主要用不同重组抗原检测血清中特異抗体。操作简单，不需要特殊仪器设备，适合现场使用。

3.3.2循环抗原（cAg）和免疫复合物（CIC）检测从患者血清和尿液中检测cAg有助于诊断活动性或现症感染。血清抗原检测也更少受包囊定位的影响，从理论上讲对治疗后的监测比监测抗体变化更具相关性。抗原检测通常使用夹心ELISA法，由于cAg浓度在血清中通常很低，因而诊断方法应尽可能敏感。将患者血清酸处理（甘氨酸/HCl或尿素）使循环免疫复合物解离，有利于提高cAg的检出。

3.5包虫病的免疫学检测结果在诊断中的意义

3.5.1包虫病免疫学诊断中的抗体人体感染包虫病后抗体有很多种，但是血清中主要是IgG抗体，其中IgG1和IgG4占优势。有学者提出可能IgG4对包虫病病人监测血清学变化有更大的特异性。但是笔者发现，IgG4确实特异性高一点，但是敏感性较低，容易造成病人漏诊，所以建议还是检测IgG的总量。通常IgG抗体阳性表示被检者曾经接触过虫卵（机体对抗原会产生抗体，但虫卵不一定能发育为病灶）或正被感染（包括没有症状和病灶的早期及现症病人），而多数患者被治愈后（手术或药物治疗）的数年包虫病抗体检测依然阳性；此外，包虫病IgG抗体阳性常常和其他带科绦虫感染存在交叉感染（假阳性反应）。检查结果的准确性和试剂的质量、操作人员的技术也有关系，所以，单纯抗体阳性结果没有诊断意义，必须结合流行病学史和其它检查。

3.5.2包虫病免疫学诊断中的抗体检测的意义辅助诊断：当被检者有流行病学接触史；或有相关症状或影像学有占位性病变但不典型，这时候可以用血清学检测结果来辅助诊断。

鉴别诊断：当有流行病学接触史；脏器上有实质性占位性病变，但影像上同单纯性囊肿、肝癌、胆囊积液、右肾积水、肝脓肿、较大血管瘤、普通钙化灶等病灶无法鉴别时，可以用血清学检测结果来鉴别诊断。

在CE血清学诊断中，由于Ag5和AgB与其他寄生虫的相同分子具有共同表位，存在交叉反应，且较高比例的CE患者血清学反应为阴性（大多数直径<3cm的CE1和部分CE4、CE5患者），所以这种情况进行患者随访和观察非常必要。在AE血清学诊断中出现IgG抗体阳性，除了通过特征性影像进行诊断外，建议补充其他检查（如肿瘤标志物）。

4小结

不管是囊型包虫病（图2）还是泡型包虫病（图3），在免疫学检测中的方法和意义还留有很大空间，特别在早期诊断（病灶尚未形成前）和患者治疗的预后、疗效判断上有着重要的研究意义。笔者也希望畜牧/兽医部门和卫生部门能够通力合作，把包虫病防控工作继续向前推进。endprint