四川三大烟区烤烟蔗糖分解酶类及其基因表达的差异分析

唐 煌,张军杰 ,鲁黎明 ,黄玉碧*

(1.四川省种子站，四川 成都 610041；2.四川农业大学生命理学院，四川 雅安 625014 ；3.四川农业大学农学院，成都 温江 611130)



四川三大烟区烤烟蔗糖分解酶类及其基因表达的差异分析

唐 煌1,张军杰2,鲁黎明3,黄玉碧3*

(1.四川省种子站，四川 成都 610041；2.四川农业大学生命理学院，四川 雅安 625014 ；3.四川农业大学农学院，成都 温江 611130)

为探究四川烟叶风格特色重要物质蔗糖对四川三大烟区烤烟品质、香气特征的影响，本研究以四川主要栽培种红花大金元和云烟87为材料，在攀西烟区(攀枝花、凉山)、川南烟区(泸州)、川北烟区(广元)驻点采样，研究烟株旺长期、现蕾期和成熟期碳代谢重要产物蔗糖相关分解酶活性及基因表达情况，初步解析影响四川烟叶风格特色重要物质蔗糖分解规律，经研究发现：1．攀西地区酸性转化酶活性呈现出先增后降的趋势，川北剑阁及川农古蔺烤烟酶活性则在旺长期最高。中性转化酶除冕宁外，各地酶活性随着烤烟生育期不断上升。各地蔗糖合成酶变化趋势一致，均出现逐渐升高的趋势。2．各烟区相比较，川南烟区及川北烟区酸性转化酶活性旺长期时达到峰值，攀西地区则在现蕾期时酶活性最高。各烟区中性转化酶活性均较低，各地差异较小。三烟区蔗糖合成酶活性均出现逐渐升高的趋势。其中酸性转化酶、蔗糖合成酶攀西烟区与川南、川北烟区差异较大，可能是各烟区烟叶香型不同的因素。3．推测蔗糖及淀粉分解酶相关基因时空表达特性分析:(1)现蕾期表达活跃型：V-inv；(2)成熟期表达活跃型：C-inv，Sus，N-inv。其中，V-inv、Sus可看作影响各烟区香型不同的因素之一。

烤烟；蔗糖；酶活性；特色风格；实时荧光定量

烟草(NicotianatabacumL.)属双子叶植物管花目茄科烟草属，是一种以收获叶片为目标的重要经济作物，因此烟叶品质的好坏直接决定着烤烟的经济价值。国内外研究表明，生态环境通过调节烟株内部的生理生化反应成为影响烟叶质量的关键因素，是优良烟叶品质形成的基础与前提[1-3]。

作为我国最为重要的烟叶主产区之一，四川各烟区区域气候特征差异明显，土壤类型分布多样，海拔跨度较大，生态环境不一，因而烤烟品质不同，抽吸风格各有特色，综合来看可将四川分为攀西烟区、川南烟区和川北烟区三大烟区。其中，攀西地区烟叶香气量较足，香气质佳，加工性好，香气特性兼有清香型和中间型。川南地区烟叶外观质量和物理特性均不如攀西地区，化学成分协调性好，但该地区的部分烟叶产区烟碱含量偏高，劲头偏大，香气特性为中间型。川北地区烟叶外观质量和物理特性较好，化学成分较为协调，但该地区烟叶还原糖含量较高，烟叶香气特性为中间型[4-5]。

烟叶品质、香气特征与烟叶碳代谢的强弱息息相关，蔗糖是烟草碳代谢的主要产物之一，对烤烟品质影响较大。一方面，在烟叶生长过程中，蔗糖作为烟草碳代谢的产物，在烤烟生命活动中有着不可替代的作用，作为糖类它是烟草生命活动的基础物质，为烟草体细胞、组织不断分裂生长提供能量，在烤烟生命活动中起主导作用。此外，蔗糖是诸多高等植物储藏、积累和运输糖分的形式，在高等植物体中具有信号的功能，还是“库”代谢的主要基质[6-7]。另一方面，在卷烟制品中，作为水溶性糖类的蔗糖在烟支燃吸时会发生酸性反应，从而抑制烟气中碱性物质的碱性，使烟气的刺激性降低，酸碱平衡适度，产生令人满意的吃味。烟叶在调制和烟支燃吸的过程中，糖类会发生美拉德反应，从而掩盖其他物质产生的杂气，产生令人愉悦的香气。此外，适宜的水溶性糖含量还能使烟叶保持色泽鲜亮，弹性好，耐压而不易破碎，油份足，为许多香气物质的形成提供碳骨架，是多种代谢次生物质的前体。因此，蔗糖是影响烤烟品质重要物质。

蔗糖含量的多少与其相关酶活性的作用息息相关。近年来人们通过对苹果、荔枝、桃[8-11]等的研究表明：与蔗糖代谢和积累密切相关的酶主要有蔗糖转化酶(Inv)、蔗糖磷酸合成酶(SPS)和蔗糖合成酶(SS)。蔗糖合成酶与蔗糖转化酶均能催化蔗糖分解，后者能够不可逆的将蔗糖分解为果糖和葡萄糖为烤烟形态建成提供碳骨架[12]。在高等植物中，蔗糖转化酶的活性对碳代谢影响很大，蔗糖通过韧皮部能从合成部位运输到需要大量能量和碳源的组织细胞中，然后在蔗糖转化酶的作用下分解为葡萄糖和果糖，经糖酵解后进入三羧酸循环，因此蔗糖转化酶的强弱常作为烤烟碳代谢强弱的衡量标准。

本研究以四川主要栽培种红花大金元和云烟87为材料，在攀枝花、凉山、泸州、广元驻点采样，研究烤烟旺长期、现蕾期和成熟期蔗糖分解相关酶活性及其基因表达情况，初步解析四川省烟叶风格特色重要物质蔗糖分解相关酶类及其基因表达规律，以探索烤烟蔗糖分解酶代谢及其基因表达对于四川省不同烟区烟叶风格的影响，找出影响四川各地区烤烟香型不同、品质不同可能存在的内在原因，为优质烟叶的生产提供理论基础，为进一步改良四川省烤烟风格提供依据。

1 材料方法

1.1 试验点及试验品种的选取

四川烤烟全年出产约为380万担，其中攀西地区生产烟叶250万担。因此在试验点的选取上，偏重与攀枝花和西昌地区。攀枝花地区选取米易与仁和2个地区，凉山选取的3个点分别为冕宁、会理、西昌。而川南和川北采集点则选取泸州古蔺县、广元剑阁县。本试验所选品种为当前四川烤烟的主推品种红花大金元和云烟87。

1.2 试验材料的采集

2013年、2014年分别在烤烟旺长期、现蕾期、成熟期的晴朗天气上午采集各地区试验田中长势基本一致且无病虫害的烟株，按“S”型取样方法，选取30株采集中部烟叶(从下往上数第10片烟叶)，每个地区每个品种采集3管烟叶，液氮速冻。两年共计在攀西烟区的西昌(XC)、会理(HL)、冕宁(MN)、仁和(RH)、米易(MY)，川南烟区的古蔺(GL)，川北烟区的剑阁(JG)7个不同取样点采集样品252份，带回实验室分装后冻存于-80℃冰箱用于酶活性及基因表达水平测定。

1.3 蔗糖转化酶的提取和测定

参照Nielsen等的方法稍作改进。中性转化酶：取0.2mL酶提液(透析过的)加入0.8mL的反应液[0.1mol/L蔗糖，0.1mol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH7.5)]在37℃热浴0.5h后，加1mL蒸馏水，1.5mL3,5-二硝基水杨酸，沸水浴5min以终止反应。用3,5-二硝基水杨酸法测定还原糖含量。还原糖产生速率，表示转化酶的活性。

可溶性酸性转化酶：取0.2mL酶提液(透析过的)加入0.8mL的反应液[0.1mol/L蔗糖，0.1mol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH4.5)]在37℃热浴0.5h后，加1mL蒸馏水，加1.5mL3,5-二硝基水杨酸，沸水浴5min以终止反应。其余操作同上。

1.4 蔗糖合成酶的提取和测定

参照Nielsen等的方法稍作改进。取0.2mL酶提液(透析过的)加入0.8mL的反应液[5%蔗糖，0.1mol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH6)，0.1mol/LUDP]在37℃孵浴0.5h后，加1mL蒸馏水，加1.5mL3,5-二硝基水杨酸，沸水浴5min以终止反应。其余操作同蔗糖转化酶。

1.5 Real-Time PCR检测

烟草蔗糖代谢相关酶关键基因序列通过NCBI、EMBL、DDBJ查阅，利用软件Primer 5.0通过相关序列设计特定引物，并检测特异性。

总RNA的提取根据北京天恩泽基因科技有限公司生产的Trizol伴侣试剂盒的说明书步骤提取RNA。

将提取到的烟草总RNA进行反转录。以纯化后的RNA为模板，根据Takara反转录试剂盒进行，反应体系总体积为20ul。

以检测合格的cDNA产物为模板，以10倍比例倍比稀释原液，制作目的标准曲线。采用双标准曲线法对样品中的基因的表达量进行Real-Time PCR检测，每个待测样品设置3次重复，选用18S作为内参基因。

1.6 数据分析

酶活性数据图、基因表达量数据图使用Excel分析，相关酶活性多重比较使用SPSS软件进行。

表1 引物设计结果

2 结果与分析

2.1 引物设计结果

2.2 不同地区烤烟蔗糖分解酶活性动态变化规律及其差异

2.2.1 酸性转化酶 由图1及表2可知，不同生态条件酶活性变现趋势不一，红花大金元方面泸州以及广元旺长期酶活性最高，到现蕾期时活性迅速下降，之后也维持在相对较低的活性水平。攀西烟区则呈现出先升后降的趋势。云烟87酶活性变化规律与红花大金元相似，泸州及广元在酶活性逐渐下降。而攀西烟区转化酶活性迅速上升，现蕾期时达到峰值，打顶略后有下降，其中会理和米易酶活性较高。

图1 酸性转化酶活性变化图

图2 蔗糖合成酶活性变化图

表2 各地区酸性转化酶酶活性多重比较表(LSD)

表3 各地区蔗糖合成酶酶活性多重比较表(LSD)

2.2.2 蔗糖合成酶 各烟区红花大金元蔗糖合成酶变化趋势一致，都呈现逐渐升高的趋势，剑阁和古蔺在各个时期蔗糖合成酶活性均较高，仁和和米易蔗糖合成酶活性较低。各地云烟87酶活性也都呈现逐渐升高的趋势，旺长期及现蕾期时酶活性处于较低的状态，打顶后成熟期时各地烤烟酶活性迅速上升达到峰值。

2.2.3 中性转化酶 由图3和表4比较可知，红花大金元中性转化酶旺长期时冕宁、会理、古蔺、剑阁活性较高，现蕾期则以冕宁、仁和酶活性较高，到成熟期时各地酶活性基本达到峰值，以广元、古蔺、仁和最高。云烟87旺长期时，冕宁、剑阁酶活性高，现蕾期时各地酶活均有上升但幅度不大，此时冕宁、仁和酶活性高，成熟期各地酶活性表现最为活跃，仁和、剑阁表现最佳。

图3 中性转化酶活性变化

表4 各地区中性酶活性多重比较表(LSD)

2.3 不同地区烤烟蔗糖分解酶调控基因表达量动态变化规律及其差异

2.3.1 酸性转化酶基因V-inv表达变化图 结合2013、2014两年数据可以得出各烟区红花大金元液泡蔗糖转化酶基因均有表达且表量较高，除剑阁和古蔺外，其余烟区基因表达量均在打顶前达到最高，打顶后进入成熟期后表达量迅速回落，而剑阁与古蔺基因表达量在旺长期时达到峰值，随后迅速下降。各地液泡转化酶基因表达量变化趋势与酸性蔗糖转化酶酶活性变化趋势相似，可以推测液泡转化酶基因在红大酸性蔗糖转化酶中起主要调控作用。云烟87方面各地酶活性表现趋势同红大相似。

图4 酸性转化酶基因V-inv表达变化

图5酸性转化酶基因C-inv表达变化

2.3.2 酸性转化酶基因C-inv表达变化图 通过柱形图，可以看出，2013年、2014年两年间各地红花大金元和云烟87基因表量相差不大且变化趋势一致，成熟期时基因表达量相对旺长期和现蕾期较高，但是相比于各自V-inv表量较低。C-inv变化趋势与蔗糖转化酶活性变化趋势并不相同，与V-inv基因表达量趋势也不相同。

2.3.3蔗糖合成酶基因Sus表达变化图 通过柱形图6可知，各烟区红花大金元蔗糖合成酶基因旺长期和现蕾期表量较低，打顶进入成熟期sus基因在此时表达量迅速上升，表达量几乎是旺长期和现蕾期表达量的两倍，这与红花大金元蔗糖合成酶活性表现趋势相同。四川各烟区云烟87蔗糖合成酶调控基因变化趋势同红大相似，这与云烟87蔗糖合成酶基因变化相似。2013年和2014年基因表达量变化相同。

图6 蔗糖合成酶基因表达变化

2.3.4 中性转化酶基因N-inv表达变化图 红花大金元中性转化酶调控基因N-inv变化规律同酶活性变化趋势相似，烤烟生长前期酶基因表达量较低，随后逐渐上升，进入成熟期后酶表达量上升明显，酶活性指数也达到峰值。通过柱形图7可知，云烟87中性转化酶基因变化规律同红大相同，基因表达量呈现出上升的趋势，在成熟期时基因表达量最高。2013年、2014年两年间基因变化规律相同。

图7 中性转化酶基因表达变化

2.4 四川不同烟区相关分解酶活性变化规律及其差异

川南烟区和川北烟区酸性酶活性在旺长期时最高，随后酶活性下降，而攀西烟区在现蕾期和成熟期时酶活性最高，且与川南烟区川北烟区酶活性差异达到显著。

表5 各烟区酸性转化酶酶活性多重比较表(LSD)

表6 各烟区中性转化酶酶活性多重比较表(LSD)

由表6可知，川北烟区中性转化酶在各个时期酶活性均较高，与攀西、川南烟区差异显著。各烟区中性转化酶均呈现逐渐升高的趋势。

表7 各烟区蔗糖合成酶酶活性多重比较表(LSD)

川北烟区蔗糖合成酶在旺长期、现蕾期、成熟期活性均较高，川南烟区蔗糖合成酶活性在成熟期时也达到较高水平，而攀西烟区酶活性相对较低，与川北、川南烟区差异显著。

3 结论与讨论

3.1 四川不同烟区碳代谢分解酶类动态变化特征及其差异

蔗糖转化酶是烤烟碳代谢的关键酶之一，在许多植物中被认为是碳代谢强度的标志。蔗糖转化酶能够将蔗糖催化分解成葡萄糖和果糖，对植物的生长发育、形态建成、抗逆性等都具有重要作用。蔗糖转化酶分为酸性转化酶和中性转化酶，在烤烟生长过程中，酸性转化酶的活性远高于中性转化酶。四川各地酸性转化酶活性较高，且品种间变化一致，从旺长期到现蕾期时酶活性不断上升，这段时间中烟叶内代谢旺盛，组织生长加快，烟叶增长增厚，此时与组织快速生长有关的酸性蔗糖转化酶活性较高。成熟期后，烟叶细胞代谢虽然依旧旺盛，但生长速率不及旺长期，更多的是烤烟中化学成分之间的相互转化，酸性转化酶活性下降。中性转化酶相比酸性转化酶活性较弱，烤烟生长前期酶活性较低，进入成熟期后各地中性转化酶活性逐渐上升，同蔗糖合成酶变化趋势相似。

蔗糖合成酶既能合成蔗糖又能分解蔗糖，但通常认为SS主要是起分解蔗糖的作用。四川各地烤烟SS动态变化规律相似，从旺长期到成熟期，SS活性一直上升，到成熟期时酶活性达到峰值。SS能够将蔗糖分解为UDPG和果糖，为细胞壁及淀粉的合成提供底物。旺长期时，淀粉不断被分解为烟株的生长发育提供能量和碳骨架，因此积累量较少，同时细胞在不断分裂，因此蔗糖合成酶活性较低酸性转化酶活性较高，成熟期时烟叶生长速率放缓，烟叶中的各种化学成分开始相互转化协调，能够调控烟叶中蔗糖水平从而影响烤烟化学成分相互转化的蔗糖合成酶活性上升，达到峰值，此时酸性转化酶活性下降，中性转化酶活性上升。从蔗糖分解酶活性变化趋势分析可推测，烤烟在生长前期主要受蔗糖转化酶中的酸性转化酶影响，后期蔗糖合成酶影响较大。

各烟区相比较，川南烟区以及川北烟区酸性转化酶旺长期时酶活性达到峰值，而攀西地区酸性转化酶在现蕾期时活性最高。各烟区中性转化酶活性较低，各地差异较小。三烟区蔗糖合成酶活性均出现逐渐升高的趋势。其中酸性转化酶、蔗糖合成酶攀西烟区与川南、川北烟区差异较大，可能是各烟区烟叶香型不同的因素。

3.2 四川不同生态区碳代谢分解酶类基因时空表达规律及其差异

依据亚细胞定位，酸性转化酶可分为细胞壁转化酶和液泡转化酶，前者属于不可溶性转化酶，后者属于可溶性转化酶。Schaffer等认为，液泡转化酶在细胞增大过程中起到主要作用。Tang等认为细胞壁转化酶的主要作用在于调节细胞壁内外蔗糖浓度梯度[13]。在烤烟中，液泡转化酶调控基因在现蕾期表达量最高，从旺长期到现蕾期是烟叶组织内能量代谢最为旺盛、生长发育最为快速的时期，细胞不断增大，烟叶不断增厚，此时酸性转化酶活性较高，而细胞壁转化酶基因、中性转化酶基因表量较低。现蕾期到成熟期，烤烟继续生长但生长速率放缓更多的是因为烤烟内部化学成分的协调平衡，液泡转化酶活性迅速降低，而细胞壁转化酶基因与中性转化酶调控基因表量上升。通过对比可知，液泡转化酶调控基因表达量变化趋势与酸性转化酶活性的变化趋势基本一致。旺长期到现蕾期时细胞壁转化酶活性调控基因和中性转化酶基因相对于液泡转化酶基因表达量较低，推测这段时间，液泡转化酶基因起主要调控作用，从现蕾期到打顶成熟期，细胞壁转化酶基因和中性转化酶基因起主要的调控作用。

各地烤烟蔗糖合成酶基因旺长期、现蕾期表量较低，成熟期时表达量达到峰值，这与蔗糖合成酶活性的变化趋势是一致的，这也与大田生长期间烤烟生长发育变化过程相似，在移栽初期，蔗糖合成酶活性较低，蔗糖积累量小，生产的蔗糖被蔗糖转化酶迅速降解，蔗糖合成酶的活性较低，因而调控蔗糖合成酶的基因表达丰度较低，到成熟期时，烟叶中积累了相对大量的蔗糖，诱导蔗糖合成酶基因表量的提升，因此蔗糖合成酶活性升高。蔗糖转化酶和蔗糖合成酶在烤烟中存在一定的分工，烤烟生长前期蔗糖转化酶起主要作用，进入成熟期后蔗糖合成酶基因表达量提升，蔗糖合成酶对烤烟的生长发育影响更大。

综上，推测蔗糖及淀粉分解酶相关基因时空表达特性分析，①现蕾期表达活跃型：V-inv。②成熟期表达活跃型：C-inv，Sus，N-inv，。其中，V-inv以及Sus基因表量相对较高且烟区之间表达差异较为明显，可能是影响各烟区香型不同的因素之一。

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2017-05-19

烟草资助项目。

唐煌(1989-)，男，硕士。*为通讯作者。