不同培养体系对小鼠胚胎体外发育的影响

邵明清,邵南齐,刘旭光

(1临汾市第四人民医院生殖医学科,临汾 041000;2郑州澍青医学院药理学教研室;3安徽农业大学动物科技学院;*通讯作者,E-mail:liuxuguang@ahau.edu.cn)

不同培养体系对小鼠胚胎体外发育的影响

邵明清1,邵南齐2,刘旭光3*

(1临汾市第四人民医院生殖医学科,临汾 041000;2郑州澍青医学院药理学教研室;3安徽农业大学动物科技学院;*通讯作者,E-mail:liuxuguang@ahau.edu.cn)

目的 探讨不同的培养液、不同培养方法及培养气相对小鼠胚胎体外发育的影响。 方法 将小鼠胚胎按不同品牌的培养液分为Cook,Quinns,Vitrolife组,这3个组以体外受精的方式获得胚胎,比较小鼠胚胎受精率、卵裂率、囊胚率;按不同的培养方法分为:单胚培养组、WOW(又叫滴中孔)组、群胚培养组,这3个组以体内受精的方式获得胚胎,比较小鼠胚胎卵裂率、囊胚率;按培养气相分为两气组、三气组,这2个组以体内受精的方式获得胚胎,比较小鼠胚胎卵裂率、囊胚率、碎片率。 结果 在培养液方面,Quinns组的受精率(90.7%)最高,Quinns,Cook,Vitrolife三组培养液在卵裂率方面差异没有统计学意义(85.4%,84.0%,84.9%，P>0.05)；在囊胚率上,Vitrolife组(89.6%)最高,三组差异没有统计学意义(P>0.05)。在培养方法上,三组卵裂率(85.5%，91.1%，89.3%)差异没有统计学意义(P>0.05),群胚培养组和WOW组囊胚率(89.1%，88.1%)显著高于单胚培养组(77.5%，P<0.05)。在气相方面,两组卵裂率(74.7%，92.6%)和囊胚率(76.4%，90.9%)差异有统计学意义(P<0.05)。 结论 不同的培养液、不同培养方法及培养气相对小鼠胚胎体外发育有不同的影响,选用Quinns培养液受精和Vitrolife培养液做后续培养,使用群胚培养法在三气(6%CO2、5%O2和89%N2)的气相环境里培养,小鼠胚胎体外发育可以获得较高的囊胚率和较低的碎片率。

胚胎发育; 培养体系; 小鼠

影响胚胎发育的培养体系包括:培养液、培养密度、气相、受精方式等[1]。如何建立最佳的体外胚胎发育培养体系是目前生殖医学领域研究的重点之一。近几年在培养体系方面有了一定的改进,但是受精率低、胚胎培养过程中碎片多、优质囊胚率低、妊娠率低等问题依然存在,这些问题依然困扰着临床医生和实验室工作人员,是临床促排卵的问题,还是实验室培养的问题，值得深入研究。

目前商品化的培养液主要有Quinns、Cook、Vitrolife等品牌,本次研究以昆明小鼠为试验材料,探讨不同的培养液、不同培养密度及培养气相对小鼠胚胎体外发育的影响,目的在于寻找一种适合昆明小鼠胚胎的培养液及培养环境,优化小鼠胚胎体外培养体系,进而为人类胚胎的体外培养提供相关依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

4-6周龄雌性昆明小鼠80只,10-12周龄雄性昆明小鼠20只,购自郑州大学实验动物中心,微生物级别:SPF,生产许可证号(SCXK(豫)2015-0005)。适应性饲养1周,排除应激反应,将精神状态欠佳者剔除。

1.2 主要试剂与仪器

孕马血清(PMSG),宁波第二激素厂生产;人绒毛膜促性腺激素(HCG),南京动物激素厂生产;培养液:Quinns、Cook、Vitrolife公司生产;血清白蛋白代用品(HSA),Cook公司生产。培养皿及圆底试管由美国Falcon公司生产;移液管及锥形试管由美国BD公司生产;CO2培养箱(Galaxy 48)由英国Galaxy生产;倒置显微镜(NikonTi)由日本Nikon生产;IVF工作站(K-systems 426Dual)由丹麦Sterile生产。

1.3 实验方法

本实验共分8个组,按不同品牌的培养液分为Cook,Quinns,Vitrolife组,这3个组研究培养液对小鼠胚胎体外发育的影响;按不同的培养方法分为:单胚培养组(每个微滴30 μl,每个微滴放一枚胚胎)、WOW(well of the well,WOW,又叫滴中孔,每孔一个胚胎)组、群胚培养组(每个微滴10个胚胎),这3个组研究不同培养方法对小鼠胚胎体外发育的影响;按培养气相分为两气组(6%CO2和94%空气的混合气体)、三气组(6%CO2、5%O2和89%N2的混合气体),这2个组研究不同培养气相对小鼠胚胎体外发育的影响。

本文中涉及到的公式如下:受精率=(受精卵数/获卵总数)×100%,卵裂率=(受精卵裂胚胎数/受精卵数)×100%,囊胚率=(形成囊胚数/所有囊胚培养的胚胎数)×100%。

1.4 小鼠体外受精胚胎在不同培养液里的发育

1.4.1 小鼠体外受精胚胎的准备 13:00时取雌性小鼠,每批取6只,每只雌鼠腹腔内注射PMSG 10 IU,经过48 h腹腔内注射HCG 10 IU,再经过17 h颈椎脱臼法处死雌鼠,无菌条件下取出输卵管,将卵丘卵细胞复合体收集到500 μl分别含有Quinns、Cook、Vitrolife品牌的受精液的培养皿中,放入37 ℃、6.0% CO2、90%以上相对湿度的培养箱中。

颈椎脱臼法处死雄鼠,在无菌条件下取出附睾尾,放入Quinns、Cook、Vitrolife液中,用1 ml注射器刺破附睾尾,精子自由游出,放入37 ℃、6.0% CO2、90%以上相对湿度的培养箱中获能60 min。

将获能的精子加入卵丘卵细胞复合体液滴内,精卵结合6 h,取出受精卵,分别放进提前平衡过的含Quinns、Cook、Vitrolife品牌的卵裂液的培养皿培养。

1.4.2 小鼠体外受精胚胎的观察 第1天把含胚胎的培养皿放在倒置显微镜的载物台上,观察卵裂情况并记录,每隔24 h观察一次,直至囊胚的形成。

1.5 小鼠受精卵在不同培养方法中的发育

1.5.1 小鼠受精卵的采集及培养 超排方法同1.4.1,HCG注射后按雌雄比例1 ∶1合笼,次日8:00时检查阴栓,将阴栓阳性小鼠处死,取出受精卵,随机分为3组,分别是单胚培养组、群胚培养组和WOW组进行培养,放进提前平衡过的Quinns、Cook、Vitrolife液滴内。

1.5.2 受精卵的观察 第1天把含胚胎的培养皿放在倒置显微镜的载物台上,观察卵裂情况并记录,每隔24 h观察一次,直至囊胚的形成。

1.6 小鼠受精卵在不同的培养气相中的发育

受精卵获得同1.5.1,自然受精后的形态正常的原核胚随机分为两组,分别使用6% CO2和94 %空气的混合气体;另一种培养气相是6% CO2、5% O2和89% N2的气体环境,观察小鼠原核胚体外发育情况,统计分析不同组别胚胎的卵裂率、囊胚率、碎片率。

1.7 统计学分析

采用SPSS16.0软件的One-Way ANOVA模块对不同组别的实验数据进行统计分析,P<0.05为差异有统计学意义,每组实验重复3次。

2 结果

2.1 不同培养液对小鼠胚胎体外发育的影响

分别在Quinns,Cook,Vitrolife三组培养液中培养小鼠胚胎,观察到的发育情况(见图1)。Quinns组的卵子受精率最高,Quinns、Cook、Vitrolife三组培养液在卵裂率差异没有统计学意义(P>0.05，见表1),在囊胚率差上Vitrolife组最高,差异没有统计学意义(P>0.05，见表1)。三种培养液均适宜培养人类胚胎。

A 原核期胚胎; B 卵裂期胚胎; C 囊胚图1 小鼠胚胎体外发育情况(×200)Figure 1 In vitro development of mouse embryos(×200)

表 1 不同培养液对小鼠胚胎体外发育的影响

Table 1 Effects of different culture media on the development of mouse embryos

组别n受精率(%)卵裂率(%)囊胚率(%)Cook150847(127/150)840(126/150)850(107/126)Quinns151907(137/151)854(129/151)891(115/129)Vitrolife159862(137/159)849(135/159)896(121/135) P>005>005>005

2.2 不同培养方法对小鼠胚胎体外发育的影响

自然受精后的小鼠原核胚随机分为3组,分别进行单胚培养、WOW组培养、群胚培养(每组10个胚胎),观察各组胚胎的发育情况。卵裂率三组差异没有统计学意义(P>0.05);囊胚率群胚培养组和WOW组显著高于单胚培养组(P<0.05,见表2)。结果表明,小鼠胚胎使用WOW组和群胚培养法的培养效果较佳。

表 2 不同培养方法对小鼠胚胎体外发育的影响

Table 2 Effects of different culture methods on the development of mouse embryos

组别胚胎数(枚)卵裂率(%)囊胚率(%)单胚培养组83855(71/83)775(55/71)群胚培养组101911(92/101)891(82/92)WOW组75893(67/75)881(59/67) P>005<005

2.3 不同培养气相对小鼠胚胎体外发育的影响

自然受精后的原核胚随机分为两组,一种培养气相是两气(6% CO2和94%空气的混合气体);另一种培养气相是三气(6% CO2、5% O2和89% N2)的气体环境,观察各组胚胎的发育情况。两组卵裂率和囊胚率差异有统计学意义(P<0.05,见表3)，三气组显著高于两气组,结果表明,小鼠胚胎使用培养气相是6% CO2、5% O2和89% N2的气体环境的培养效果较佳。通过胚胎碎片的比较,结果显示:胚胎中所含碎片比例为0%-5%,6%-20%,>20%在两组中分别为19.8%与48.4%，36.3%与32.6%，44.0%与18.9%，两组比较差异有统计学意义(P<0.05，见表4)。说明碎片的多少与气相有一定的关系,分裂及生长速度三气组明显优于两气组。

表 3 不同培养气相对小鼠胚胎体外发育的影响

Table 3 Effects of different gas conditions on the development of mouse embryos

组别胚胎数(枚)卵裂率(%)囊胚率(%)两气组91747(68/91)764(52/68)三气组95926(88/95)909(80/88)P<005<005

表 4 不同培养气相对小鼠胚胎碎片的影响

Table 4 Effects of different gas conditions on the fragmentation of mouse embryos

组别胚胎数(枚)碎片率(%)0%-5%6%-20%>20%两气组91198(18/91)363(33/91)440(40/91)三气组95484(46/95)326(31/95)189(18/95)P<005>005<005

3 讨论

培养液发展经历了从单一培养基到序贯培养基的发展历史[1],简单培养基由几种常规无机盐类并添加能量底物,而复杂培养基除这些成分以外,还含有维生素、氨基酸、嘌呤、核苷酸及微量表面活性剂等诸多成分[1]。在体外培养的不同时间,胚胎对培养液的成分会有不同的要求,使用单一培养液显然是不够的。

培养液的稳定性直接决定胚胎培养结局,因此,选择生产工艺成熟厂家的培养液至关重要,由于商业机密的原因,大多培养液的具体配方没有公开,因此,新进培养液必须进行质控,只有质控合格的培养液才能用于人类胚胎的培养,否则,一时的疏忽,可能给患者带来意想不到的后果。本研究涉及的三个品牌的培养液Quinns、Cook、Vitrolife培养液在卵裂率、囊胚率上差异没有统计学意义(P>0.05),Quinns组的受精率最高,三组培养液均适宜培养人类胚胎,与宋冰冰等[2]的结果类似。

目前常用的胚胎培养方法主要有:微滴法、WOW法、群胚培养法等[3],微滴法原理是将胚胎聚集在一个较小的区域以达到充分利用自分泌和旁分泌效应的目的,微滴的体积一般为10-50 μl。WOW培养法,由于胚胎之间相互隔离,且每枚都位于WOW中,不但可以使胚胎分泌的一些因子不被稀释以自分泌方式作用于自身,还可以阻止有毒物质作用于正常胚胎。本次研究结果表明:单胚培养组、WOW组、群胚培养组胚胎的发育情况在卵裂率水平上,三组差异没有统计学意义(P>0.05);在囊胚率上,群胚培养组和WOW组显著高于单胚培养组(P<0.05)。在多种动物模型上的研究表明[4],增加培养密度可以提高胚胎的发育潜能,可能与胚胎自分泌或旁分泌效应有关。基于上述效应,培养过程中使用体积较小的培养液滴并缩小液体表面积促使营养因子尽可能聚集浓缩可显著提高胚胎的发育潜能[5]。

但是对于人类胚胎,需要对每个胚胎都要进行细致的观察,群胚培养无法区别多精受精的情况,因此还是单胚培养,从本次研究看,群胚培养组和WOW组显著高于单胚培养组,有报道用WOW系统培养牛的胚胎[6],兼有单胚培养与群胚培养的优势,WOW培养体系的半开放环境不仅稀释了培养过程中堆积的代谢产物(如氨、自由基等)的毒性作用,而且还在每个微孔内的胚胎周围聚集了胚胎自分泌或者旁分泌的生长因子,进而促进胚胎的发育。此法能否用于人的胚胎培养,仍需要进行更加深入的研究。鉴于自制WOW培养皿时,烧烫塑料培养皿会有有害物质产生,如果有商品化的WOW培养皿,效果会好一点。

除培养基、培养方法外,培养气相也是影响胚胎培养效果的一个重要因素。本次研究表明:在卵裂率和囊胚率上,两气组和三气组差异有统计学意义(P<0.05),原因在于三气组中低氧可减少培养中自由基和活性氧(ROS)的形成,而活性氧对细胞有毒害作用,易造成DNA损伤和脂质过氧化反应[7]。而高氧环境(体积分数20% O2)会产生更多的活性氧,从而影响胚胎的发育潜能[8]。

低氧除要求气相中氧气含量低外,还要求实验室人员操作胚胎时要迅速,减少胚胎在空气中的暴露时间,特别是做卵泡浆内单精子注射(ICSI)时,应该先把精子制动后,再把卵子转移到ICSI皿中,再者,观察胚胎要迅速。胚胎在体外培养时,要尽量减少培养液pH的变化,pH与CO2存在一定的关系,适宜的酸碱度是维持胚胎正常发育的重要条件,一旦环境的pH值发生改变,将会影响胚胎的发育。碎片是胚胎体外培养中经常出现的现象,产生原因可能与配子的质量、实验室的环境质量如温度或pH变化及促排卵用药方案有关。本次研究显示,在三气组的气相环境中,碎片较两气组中少,可能与低氧环境产生更少的活性氧有关。龙鼎新等[9]实验结果表明,较低或较高的pH环境均可以降低胚胎的存活率,增加致畸率和死亡率,最终表现为胚胎发育异常或死亡。因此,胚胎培养的外界环境要尽量与体内环境一致,本次实验表明胚胎在6% CO2、5% O2和89% N2的气相环境中可以取得较好的发育效果。

由于受实验条件的限制,本实验室的培养体系还是静态培养体系,今后研究的方向应该是动态培养体系,如摇动/转动体系、倾斜培养体系、振动培养体系、控制液体流动培养体系等,时差成像系统(time-lapse imaging,TLI)作为一种新的动态观察胚胎培养体系,越来越受到临床医生与胚胎学家的青睐。胚胎学家应用这一系统后,可以通过视频图像连续观察其整个动态发育过程,而不需将胚胎从培养箱中取出。但TLI系统的安全性有待进一步评估[10]。再者仪器昂贵,限制了在一般生殖中心的推广。因此,对大多数刚开展的生殖中心来说,还是应该采用成熟的培养体系。

本研究的结果表明,不同的培养液、不同培养方法及培养气相对小鼠胚胎体外发育的有不同的影响,选用Quinns培养液受精和Vitrolife培养液做后续培养,使用群胚培养法在三气(6%CO2、5%O2和89%N2)的气相环境里培养小鼠胚胎,可以获得较高的囊胚率和较低的碎片率。

[1] 黄国宁,孙海翔.体外受精-胚胎移植实验室技术[M].北京:人民卫生出版社,2012:191-212.

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Effect of different culture systems oninvitrodevelopment of mouse embryos

SHAO Mingqing1,SHAO Nanqi2,LIU Xuguang3*

(1ReproductiveCenterofLinfenFourthPeople’sHospital,Linfen041000,China;2DepartmentofPharmacologyofZhengzhouShuqingMedicalCollege;3CollegeofAnimalScienceandTechnologyofAnhuiAgriculturalUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:liuxuguang@ahau.edu.cn)

ObjectiveTo investigate the effects of different culture media, different culture methods and culture gas on theinvitrodevelopment of mouse embryos.MethodsThe mouse embryos was divided into Cook group, Quinns group, Vitrolife group according to different brands of culture medium. The embryos were obtained byinvitrofertilization among three groups, and the fertilization rate, cleavage rate and blastocyst rate were compared. According to different culture methods, the experiment was divided into single embryo culture group, WOW group and multiple embryos group. The embryos were obtained byinvivofertilization among these groups to compare cleavage rate and blastocyst rate.According to the culture phase, the experiment was divided into two gas group and three gas group. The embryos were obtained byinvivofertilization in the two groups to compare the cleavage rate, blastocyst rate and Fragmentation rate.ResultsThe fertilization rate was the highest in Quinns group(90.7%).There was no significant difference in cleavage rate among three groups(85.4%,84.0%,84.9%,P>0.05).The blastocyst rate was the highest in Vitrolife group(89.6%), and there was no significant difference among three groups(P>0.05). There was no significant difference in cleavage rate among three culture methods(P>0.05). Blastocyst rates in multiple embryos group and WOW group were significantly higher than that of single embryo culture(89.1%,88.1%vs77.5%,P<0.05). There was significant difference in cleavage rate(74.7%,92.6%) and blastocyst rate(76.4%,90.9%) between two culture gas groups(P<0.05).ConclusionThe different culture medium, different culture methods and culture gas have different effects on mouse embryo developmentinvitro.The results suggest that Quinns medium as fertilization media,Vitrolife media as the following culture media, multiple embryos group culture method and three gas(6%CO2, 5%O2and 89%N2) as culture environment can have higher blastocyst rate and lower fragmentation rateinvitrodevelopment of mouse embryos.

embryo development; culture system; mouse

安徽省科研资助计划项目(自然科学)(2006jq1128)

邵明清,男,1982-02生,硕士,实验师,E-mail:shaomingqing@126.com

2017-03-19

S814.8

A

1007-6611(2017)07-0654-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.07.004