旱柳细菌性枯萎病室内药效筛选1)

刘忠玄 赵佳 刘雪峰 成丽萍 曹俊平 王光明

(东北林业大学，哈尔滨，150040) (内蒙古乌审旗森防站) (内蒙古伊金霍洛旗森保站)



旱柳细菌性枯萎病室内药效筛选1)

刘忠玄 赵佳 刘雪峰 成丽萍 曹俊平 王光明

(东北林业大学，哈尔滨，150040) (内蒙古乌审旗森防站) (内蒙古伊金霍洛旗森保站)

为了有效地防治旱柳细菌性枯萎病，在PDA培养基上，运用打孔注药方法分别测试了14种杀菌剂对该病病原菌(Pantoeaagglomerans(Ewing and Fife) Gavini et al.)的抑菌效果。通过比较抑菌率和r值的大小评价各药剂的抑菌效果，以确定药效。结果表明：供试药剂中有13种对该病原菌有抑菌效果，其中农用链霉素、四霉素、乙蒜素和中生菌素的作用效果较明显。

旱柳细菌性枯萎病；药剂筛选；抑菌效果；成团泛氏菌

Bacterial wilt of willow; Screening of drugs; Bacteriostatic effect;Pantoeaagglomerans(Ewing and Fife) Gavini et al.

旱柳(SalixmatsudanaKoidz)是内蒙古鄂尔多斯地区种植最广泛的乔木之一，属杨柳科、柳属，喜光，耐寒，湿地、旱地皆能生长，根系发达，抗风能力强，生长快，易繁殖[1]。在内蒙古这种特殊的地理气候条件下旱柳已成为重要的森林骨骼，不仅能防风固沙而且是很好的牛羊食料[2]。但近年，旱柳枯萎病在鄂尔多斯地区发生日渐严重，在春季和夏季起初的症状表现为柳树的叶片和树枝突然枯萎，有些树枝和树干快速的落叶，然后干枯死亡。切开感病树枝或树干，在边材部位可以观察到一条明显呈环状的红褐色或棕黑色条带，条带处有大量的液体流出并伴有恶臭味。大面积感病时，由远处看犹如一片火烧林。另外，由于连年发生病害，致使树木长势衰弱，引起天牛和蝉等昆虫再危害。

国内金九辰等[3]对西宁地区的柳树细菌性枯萎病进行了研究，发现该病害由柳欧文氏杆菌(Erwiniasalicia)引起，该研究进行了病害调查和防治工作，但未提出良好的防治方法。国外虽然没有对旱柳细菌性枯萎病的相关记载，但却有一种由柳欧文氏杆菌引起的柳树水印病的病害与旱柳细菌性枯萎病症状相类似。早在1924年荷兰科学家Day[4]就首次发现并确定其能够引起板球拍柳细菌水印病。国外学者Lindeijer、Dowson、Gremmen和DeKam等[5-9]也对该水印病进行了相关研究，目前在英国、荷兰、比利时、澳大利亚、美国、日本都有关于柳树水印病的报道，但是都没有很好的防治方法。2014年到2016年，经林间调查发现，该病害的潜育期长达2年；病原菌主要在感病树体内越冬，下年病原菌通过修枝、捅枝等伤口继续侵染。该病害为木质部病害，林间防治时，打孔注药或灌根施药方法比较合理，喷雾或涂抹施药方法药剂难以进入树体并疏导到靶标位置。因此，为了有效防治旱柳细菌性枯萎病，进行了杀菌剂对旱柳细菌性枯萎病的药效筛选试验。

1 材料与方法

1.1 供试菌种

病害标本采集于内蒙古鄂尔多斯地区。对发病组织进行镜检，并采用常规的细菌分离方法进行菌株分离和纯化，得到纯净的菌株，再重新接种到健康的旱柳枝干进行致病性测定。根据柯赫氏法则，对引起感病症状的病树进行分离纯化。运用细菌鉴定方法，对比前后菌株，确定引起鄂尔多斯旱柳枯萎病的病原菌为成团泛氏菌(Pantoeaagglomerans(Ewing and Fife) Gavini et al.)[10]。

1.2 供试药剂

以常见植物细菌病害的室内药剂筛选方法为参考[11-16]，结合实际生产条件，进行试验方案设计。根据实际情况，旱柳细菌性枯萎病的发病部位在植物的木质部，一般不能采取喷雾式施药方法，应采用灌根或打孔注药的施药方法，使药剂更容易被植物吸收。但已有剂型中没有打孔注药的药剂剂型，因此，选择已有剂型中的14种药剂进行药剂筛选试验(表1)。

表1 旱柳细菌性枯萎病室内筛选药剂

1.3 药剂对病原菌生长抑制测定

采用打孔注药测量抑菌圈大小的方法研究药剂对病原菌的抑制作用。在前期的该病原菌培养基筛选中发现PDA培养基更适合其生长，细菌生长更黏稠、浓密、并且生长速度更快，所以选择PDA作为对峙培养基。配制标准PDA培养基，准备干净的90 mm培养皿若干，121 ℃灭菌20 min。烘干培养皿，用无菌注射器注入20 mL PDA培养基到培养皿内，凝固后加入400 μL经过180 r·min-1离心、29 ℃培养48 h的病原菌原液，再用灭菌的涂布器进行均匀涂布，然后使用无菌的8 mm外径的打孔器在培养基上均匀打孔4个，用100 μL的枪头向各个孔内分别加入相应处理药液50 μL，每种药剂分别稀释100、200、400、600、800、1 000倍作为初筛试验组(表2)。每种药剂的每个处理重复3个培养皿。放入培养箱中29 ℃培养48 h后测量打孔周围抑菌圈的大小，求取各处理下抑菌圈的平均值。同样方法设置空白对照组，药液改为无菌水，测定抑菌圈大小。根据药剂产品说明换算每种处理下用药量，再与抑菌圈大小进行对比，筛选出高效药剂。计算出用药量、用药质量浓度与抑菌圈的函数关系。根据以上测试结果，使用上述方法，对有效范围超过1 000倍的药剂设置更加广谱的药液质量浓度，测出药剂的最低有效质量浓度。每种药剂每个处理进行3组重复，每组重复打孔4个，孔径8 mm，共测定抑菌圈12组，平均抑菌直径(Dr)计算公式：Dr=∑(D1+D2+D3+…+D12)/12。

2 结果与分析

2.1 药剂对病原细菌生长的抑制作用

从表2可知，14种药剂中的13种药剂均有抑制病原菌生长的效果，但相互之间存在较大差异。根据抑菌圈的大小和抑菌率可以看出，14种药剂中1-3号药剂药效较好，100倍时，抑菌圈直径均超过1.5 cm，抑菌率均在75%以上。1号药剂的药效最好，400倍时，抑菌率仍在75%以上(图1)。

A、B.400倍农用链霉素抑菌效果；C、D.400倍四霉素抑菌效果。

2号药剂的抑菌率仅次于1号药剂，但有效成分质量浓度处于14种药剂中较低水平，因此，需要应运用各种药剂的抑菌圈直径(D)与有效成分质量浓度(M)的比值(r)来评价各个药剂有效成分的作用效果。由表2可见，14种药剂中2号和13号药剂的r值较大，其次是5号药剂，排在第四的是12号药剂，而抑菌率最大的1号药剂却仅排第五。14号药剂的r值为0，对病原菌无抑菌效果。

表2 14种药剂的不同处理对旱柳细菌性枯萎病的抑制作用

药剂编号1800倍液MD/cmP/%r5400倍液MD/cmP/%r16200倍液MD/cmP/%r20000倍液MD/cmP/%r10.40000.731.111.75000.13330.522.223.75090.04400.313.336.81820.036000020.001700000000030000000040000000050000000060000000070000000080000000090000000010000000001100000000120000000013000000001400000000

注：M为药剂有效成分质量浓度(g·L-1)，枯草芽孢杆菌的有效成分浓度用亿个菌·mL-1进行计量；D为抑菌圈直径；P为抑菌率；r=抑菌圈直径(D)/有效成分质量浓度(M)。

2.2 不同药剂失效的临界质量浓度

不同药剂的稀释倍数相同，有效成分却不同，抑菌率也有所差异。如表3所示，当1号药剂用药浓度为20000倍时失去抑菌的药效，而2号药剂稀释1800倍时候就失去药效，但当分别将2种药剂稀释到相应的失效的临界稀释倍数时，对比2种药剂的有效成分质量浓度，发现1号药剂的有效成分为0.044 0 g·L-1，而2号药剂为0.001 9 g·L-1，相差20多倍。

表3 药剂失效的临界稀释倍数下的有效成分

2.3 林间药剂防治的成本估算

抑菌试验以及各药剂r值分析结果表明，1-3号药剂以及5号和12号药剂的防治效果较好。根据2015年5月在乌审旗乌审召使用农用链霉素进行林间防治的成果，结合当时资本耗费情况和当地消费水平，进行成本估算。按照每人每天工作8 h，平均完成200株柳树防治工作，再参考鄂尔多斯的物价水平以及考虑野外作业危险性和辛苦程度，核算人工费和汽油费，合计为劳务费。计算出每万棵感病柳树的劳务费为1万元。根据柳树胸径和打孔数量估算，每万棵树田间施药量约为200 L。通过分析抑菌率和r值大小，分别选取该5种药剂100、200、400倍液，进行成本估算。每万棵感病柳树的防治成本=施药量/稀释倍数×药剂成本+劳务费，核算结果如表4所示。药剂的防治成本估算结果表明，劳务费占主要的部分，且各药剂对每万棵柳树的防治成本较接近，因此，旱柳枯萎病病原菌的防治药剂应该主要根据药剂抑菌的效果进行选择。

表4 药剂的成本估算

3 结论与讨论

供试的14种药剂中，除了14号药剂外的13种药剂都对该病原菌的生长有抑制作用。其中13号药剂枯草芽孢杆菌为生防菌药剂，其防治效果不理想，因此，生防菌试剂对柳树细菌性病害的防治还需进一步筛选。其他药剂中，1号和2号药剂的抑菌效果优于其他药剂，1号药剂100倍稀释液的抑菌率达97.78%，且成本与其他药剂成本相差不多，可以考虑使用。1号药剂200倍液和2号药剂的100倍液的抑菌率均为84.44%，成本较低，建议使用该浓度下的这2种药剂进行田间防治试验。若不使用成品药剂防治，利用药剂中有效成分配制病害防治药剂，根据r值大小的比对结果可知，2号和5号的r值较高，若利用2号和5号药剂的有效成分配制防治药剂，可能会产生更好的防治效果。因此，1号农用硫酸链霉素和2号四霉素是本试验筛选得到的较有效的药剂；2号四霉素和5号中生菌素有效成分的抑菌效果最好，可考虑配制药剂进行防治；其他药剂如3号乙蒜素和12号噻霉酮可酌情使用。本次药剂的筛选为鄂尔多斯柳树细菌性枯萎病的防治提供了理论依据，也为田间防治工作奠定了良好的基础。

产品说明书试验用量针对的是田间施药的最佳方案，本次试验的实验室筛选结果与其用量有一定差异，但14种药剂中大部分药剂室内筛选的有效质量浓度范围在建议施药的质量浓度范围之内，因此并不影响其用于鄂尔多斯旱柳细菌性枯萎病病原菌的田间防治。14种药剂的施药稀释倍数从200～4 000倍各不相同，7号药剂在果树上施药时稀释倍数能达到2 500～4 000倍，但在本试验中稀释至1 200倍时，就已经失去药效。理论上用药浓度越大，抑菌效果将会更好，但是在田间施药时候，要考虑到环境保护、动植物保护、保护施药人员安全、水源污染等等因素，才能给出科学合理的施药浓度。

试验发现，各药剂临界失效稀释倍数和有效成分质量浓度均不相同，形成此差异的主要原因可能是由于各种药剂的原剂有效成分质量浓度不同，也可能是各个药剂自身的药效有所差异。因此，在进行药剂筛选时，不能单纯根据各农药不同稀释倍数下的抑菌率来评价抑菌效果，应综合考虑抑菌直径(D)与有效成分质量浓度(M)的比值(r)的大小，以及各药剂失效的临界稀释倍数下的各药剂的有效成分质量浓度的多少，才能客观评价抑菌的效果。

本试验采用的打孔注药的方法与产品说明书上的建议施药方法不同，主要由于成品药剂中没有打孔注药的剂型，但打孔注药的方法在病虫害的防治中起着至关重要的作用，该方法能使药剂通过木质部的导管传输到树木的每个部位，防治效果好，且污染小，安全性高。因此，建议生产打孔注药这一剂型。

本研究对14种药剂进行了室内药剂筛选，得到了几种高效的药剂，为该细菌性病害的防治提供了依据，也为防治工作奠定了基础。但要投入林间防治，还需要先进行林间小范围的试验后才能进行大面积推广，林间试验需要重点考虑柳树的品种、气候、温度、降雨以及施药方式和施药时间、环境和人员安全等因素。运用林间试验结果，结合药剂造价成本和安全性因素，最终决定最佳的防治药剂，这些还有待进一步研究。

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刘忠玄，男，1991年6月生，东北林业大学林学院，硕士研究生。E-mail：2825088250@qq.com。

刘雪峰，东北林业大学林学院，研究员。E-mail：757489401@qq.com。

2016年10月21日。

S763.1

1)事业单位委托科技项目(2015-170)。

责任编辑：程 红。

Indoor Screening Fungicides of Willow Bacterial Wilt Disease//Liu Zhongxuan, Zhao Jia, Liu Xuefeng(Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China); Cheng Liping, Cao Junping(Forest Protection Station, Wushen County in Inner Mongolia Autonomous Region); Wang Guangming(Forest Protection Station, Ejin Horo Banner in Inner Mongolia Autonomous Region)//Journal of Northeast Forestry University，2017,45(3)：82-85,101.

In order to prevent and control the willow wilt disease effectively, the bacteriostatic effect of 14 drugs on the pathogen was tested by perforating drug injection in PDA media. The bacteriostatic effect of each drugs was evaluated by comparing the inhibitory rate and the value ofr. Thirteen of the tested drugs had bacteriostatic effects on the pathogen. The bacteriostatic effect of streptomycin, tetramycin, ethylicin and zhongshengmycin was good. Streptomycin and tetramycin had the best bacteriostatic effect, which is the best drugs selected in this experiment.