鱼皮胶原蛋白肽脱腥脱色工艺研究

大连海洋大学食品科学与工程学院丛瑶黄婧阿依夏穆·买买提蒋仕洁石佳琦徐晨辉温凤凌赵慧

鱼皮胶原蛋白肽脱腥脱色工艺研究

大连海洋大学食品科学与工程学院丛瑶黄婧阿依夏穆·买买提蒋仕洁石佳琦徐晨辉温凤凌赵慧

本实验以鲤鱼皮为原料，通过蒸煮法制备明胶，选用水解度高的胰蛋白酶和中性蛋白酶对明胶进行酶解，研究了D4006、D3520、X-5、AB-8四种吸附树脂对鲤鱼皮明胶水解液脱腥、脱色的效果；测定吸附后产物的蛋白损失率，并进行感官评价，筛选出树脂类型。通过测定，胰蛋白酶水解度为19.19%，中性蛋白酶为15.25%；D4006树脂对中性蛋白酶的明胶水解液脱腥、脱色的效果最佳，此时条件为树脂与酶解液之比为5g∶100ml，脱腥、脱色时间为3h，温度为25℃。

鲤鱼皮；明胶；酶解；树脂；脱腥与脱色

胶原蛋白多存在于动物的真皮、肌肉、骨骼等部位，约占动物体内总蛋白质含量的25%～30%[1]，在生物体器官组织的形成中起重要作用，并参与细胞多种功能的表达。胶原蛋白在生物制药上有广泛的应用，包括治疗骨关节炎、高血压，以及植入人体，用于组织的再生和修复[2-5]。明胶是在胶原蛋白的基础上将动物的皮、骨、韧带等进行精制后得到的一种胶体物质，是胶原蛋白的变性产物，可作为食物的稳定剂、增稠剂，也可应用于糖果中，使其更加坚韧、具有弹性。

胶原蛋白和明胶多来源于牛、猪，但随着疯牛病、口蹄疫的传播及宗教因素影响，限制了该类动物胶原蛋白的应用[6]。我国海洋渔业资源极为丰富，在鱼类加工过程中会产生大量未被利用的皮、鳞、骨和鳍等下脚料。因此，以鱼类下脚料作为胶原蛋白、明胶的来源，既可避免疾病风险，也可提高鱼类加工利用率。由于胶原蛋白和明胶分子量较大，导致生物体吸收缓慢，而利用酶法将其水解成分子量较小的生物活性肽，可减小人体肠胃消化吸收的负荷，利于发挥其效应[7]。但由于鱼类明胶的酶解产物会带有一定的色素和腥味，阻碍了其在食品行业的推广和发展，因此对胶原蛋白肽的脱腥脱色已成为一项重要的研究内容。

脱腥脱色的方法可分为感官掩蔽法、物理法、化学法、生物法[8]，实验中常见有活性炭法、氧化还原法、酵母法及树脂吸附法等[9-10]。其中树脂吸附法对有机物有较好的选择性，可以分离有毒物质，吸附量大、机械强度高，同时树脂的物理和化学性质也较为稳定，并且一般利用水、稀酸稀碱或者有机溶剂即可令其再生。

本实验以鲤鱼皮为原料制备明胶多肽，对不同树脂的脱腥脱色效果进行对比分析，确定了明胶多肽的提取、脱腥脱色条件。

1 材料与方法

1.1 原料及试剂

原料：鲤鱼皮。

试剂：氢氧化钠、冰乙酸、氯化钠、石油醚、水合茚三酮、L-酪氨酸、无水碳酸钠、四硼酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠，均为分析纯。

酶制剂：木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶均购于天津市诺奥科技发展有限公司；胃蛋白酶购于上海莲冠生物化工有限公司。

树脂：D4006型树脂、X-5型树脂、D3520型树脂、AB-8型树脂购于天津南开大学树脂有限公司。

1.2 仪器设备

BS224S分析天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司；

101-2-BS电热恒温鼓风干燥箱：上海跃进医疗器械厂；

PHS-3C型精密PH计：上海安亭昌吉路149号雷磁仪器厂；

721可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司；

YXZ80B高温高压蒸煮锅：上海三申医疗器械有限公司；

HJ-6多头磁力加热搅拌器：常州国华电器有限公司；

RE-52C旋转蒸发器：巩义市予华仪器有限责任公司；

SCIENTZ-10N冷冻干燥机：宁波新芝生物科技股份有限公司；

WD-9405A脱色摇床：北京六一仪器厂。

1.3 主要方法

1.3.1 鲤鱼皮基本组分测定

水分：GB5009.3—2010《食品安全国家标准〈食品中水分的测定〉》；

灰分：GB5009.4—2010《食品安全国家标准〈食品中灰分的测定〉》；

粗蛋白质：GB5009.5—2010《食品安全国家标准〈食品中蛋白质的测定〉》；

粗脂肪：GB14772—2008《食品中粗脂肪的测定》。

1.3.2 原料预处理

将鲤鱼皮浸泡在0.1mol/LNaOH、NaCl的混合溶液（V/V=1：1）中4～6小时，用蒸馏水清洗至中性后浸泡于1%醋酸溶液中10min，除去鱼表层黑皮及杂质。

1.3.3 鱼皮胶原蛋白肽的制备

将预处理后的鱼皮与蒸馏水按料液比1∶3混合，调节pH值至6～6.5，在121℃下蒸煮20min，抽滤、冷冻干燥得到明胶固体。

配制4%的明胶（W/V）溶液，分别加入表1[11]中5种蛋白酶（W/V=4：100），依照对应条件酶解明胶溶液，恒温酶解6小时[13]，反应结束在100℃下灭酶10min。

表1 蛋白酶最适反应条件

1.3.4 蛋白质水解度测定

采用茚三酮比色法[12]测定明胶水解液水解度，筛选出A、B两种效果较好的酶解液。

1.3.5 明胶酶解液的脱腥、脱色

采用D4006型、D3520型、X-5型以及AB-8型四种吸附树脂对A、B水解液进行脱腥脱色处理。向250ml锥形瓶中分别加入5g树脂和100ml酶解液，在25℃下恒温振荡3h，抽滤后取上清液冷冻干燥并称量，设置空白组（即不加入任何树脂）作为对照，计算蛋白质损失率。

1.3.6 感官评价

培养10名感觉器官机能良好[13]的检察人员对脱腥脱色后的产物从色泽、气味以及滋味三方面进行感官评价，并按照表2填写评价表格；对10名检查人员的感官评价作统计并计算分析，分值越小表明测定结果越好。

表2 脱腥脱色评价标准

2 结果与讨论

2.1 鲤鱼皮基本组分分析

参照《食品安全国家标准》测定方法进行测定，结果如表3所示。鱼皮的基本组分含量如下：

表3 鲤鱼皮基本组分含量

由表3可看出，鲤鱼皮蛋白质的含量约占鱼皮干重的28.32%，胶原蛋白十分丰富，表明鲤鱼皮具有很高的研究价值。本实验中利用蒸煮法提取鱼皮明胶产率占鱼皮干重的68.31%，与鱼皮初始蛋白质含量相比减少了17.09%，而产生这一差值的主要原因是在去除鱼皮黑色表皮过程中损失了部分胶原蛋白。

2.2 蛋白酶水解度分析

2.2.1 标准曲线的测定

以明胶蛋白质为横坐标测定数值，以吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线（图1）。

图1 蛋白酶水解度测定标准曲线

图1所示的标准曲线线性回归方程：y=1.1450x-0.1442，R2=0.9910；该标准曲线R2值趋近于1，说明线性回归好，数据与曲线吻合度高。

2.2.2 不同蛋白酶水解度的测定

根据待测样品的光密度值从所绘制的标准曲线上查得明胶蛋白质含量，并根据蛋白酶水解度公式计算出中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶及胃蛋白酶五种不同酶解液蛋白质的水解度（图2）。

图2 蛋白酶水解度测定结果

由图2可看出，在酶最适条件下反应相同时间，五种蛋白酶对鱼皮明胶的酶解均有一定效果，其中蛋白质水解度较高的两种酶依次为胰蛋白酶和中性蛋白酶，水解度分别是19.19%和15.25%，因此，可筛选出的胰蛋白酶和中性蛋白酶的酶为酶解使用酶。

2.3 明胶酶解液脱腥、脱色分析

用D4006型、D3520型、X-5型以及AB-8型树脂分别对胰蛋白酶、中性蛋白酶两种酶解液分别进行脱腥脱色处理，并将样品冷冻干燥，计算得到两种酶解液的蛋白质损失率（图3）。

图3 蛋白质损失率

由图3可看出，在相同反应条件下，中性蛋白酶酶解液的蛋白质损失率普遍低于胰蛋白酶酶解液，且经D4006型吸附树脂处理过的鱼皮明胶酶解液的蛋白质损失率低于其他型号树脂，其中经D4006型树脂吸附后的中性蛋白酶酶解液效果最佳，其蛋白质损失率为7.27%。

2.4 感官鉴定评估结果分析

D4006型、D3520型、X-5型和AB-8型树脂对中性蛋白酶、胰蛋白酶两种酶解液脱腥脱色后的感官评价结果（图4～图6）。

图4 不同树脂对中性蛋白酶酶解液脱腥脱色感官评价

由图4可知，空白组在色泽、气味和滋味三方面的感官分值分别为2.6、3.7、3.4，与空白相比较，经不同树脂处理后的样品感官分值均低于空白组，表明上述四种树脂对中性蛋白酶酶解液具有一定的脱腥脱色效果，处理后的样品在色泽、气味及滋味方面有明显的改善。其中，对中性蛋白酶酶解液脱色效果较好一组为X-5型树脂组，平均分值为1.6；脱腥效果较好的是D4006型树脂组，分值为1.8；口感滋味较好的是D4006型，分值为2.3。

图5 不同树脂对胰蛋白酶酶解液脱腥脱色感官评价

由图5可知，空白组在色泽、气味和滋味上的感官分值依次为4.7、3.0、3.5，与空白组相比，实验组在色泽、气味和滋味上均得到了一定的改善，其中对胰蛋白酶酶解液脱色效果较好的树脂为D4006型树脂，平均分值为3.0；脱腥效果较好的是D4006型树脂，分值为2.3；而口感滋味较好的是X-5型，分值为1.7。

图6 蛋白酶酶解产物脱腥脱色整体感官评价

由6图可知，四种树脂对中性蛋白酶酶解液的脱腥脱色效果优于胰蛋白酶酶解液，经D4006型树脂吸附后的酶解液整体感观评价也优于其他型号树脂，且经D4006型树脂吸附后的酶解液的蛋白质损失率也低于其他实验组。中性蛋白酶价格较低，适合工业化推广，所以可以选用中性蛋白酶酶解鱼皮明胶，并利用D4006型树脂对明胶酶解液进行脱腥脱色处理。

3 结论

（1）通过测定蛋白质水解度，从中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶中选取水解度较高的胰蛋白酶和中性蛋白酶两种酶解液，水解度分别为19.19%，15.25%。

（2）对两种酶解液分别用D4006、D3520、X-5和AB-8树脂进行脱腥、脱色研究，经D4006树脂处理过的鱼皮明胶酶解液的蛋白质干重损失率与感官评估分值较低，其中胰蛋白酶水解液干重损失率为7.97%，中性蛋白酶为7.27%。

（3）以D4006树脂的脱腥脱色效果最佳，此时脱腥脱色条件为树脂与鱼皮明胶酶解液料液比为5g∶100ml，反应时间3h，温度为25℃。

[1]蒋挺大.胶原与胶原蛋白[M].化学工业出版社,2006.

[2]GómezguillénMC,GiménezB,LópezcaballeroM E,etal.Functionalandbioactivepropertiesofcollagenand gelatinfromalternativesources：Areview[J].FoodHydrocolloids, 2012,25(08)：1813～1827.

[3]ZengL,LiLI,WangJB.ResearchProgressin FunctionCharacteristicsandPreparationTechnologyofAquatic CollagenProteinPeptidesLiteratureReview[J].Journalof ZhejiangOceanUniversity,2013.

[4]MaL,GaoC,MaoZ,etal.Enhancedbiologicalstability ofcollagenporousscaffoldsbyusingaminoacidsasnovel cross-linkingbridges.[J].Biomaterials,2004,25(15)：2997～3004.

[5]傅燕凤,沈月新.浅谈鱼皮胶原蛋白的利用[J].食品研究与开发,2004,25(02)：16～18.

[6]尹利端,石丽花,王桐等.海洋胶原蛋白肽在功能性食品中的应用[J].明胶科学与技术,2013,33(02)：55～58.

[7]宋维春,徐云升.水解明胶运动饮料的研究[J].食品工业科技,2005(02)：138～139.

[8]冯怡,汪薇,任文彬等.鱼制品脱腥方法的研究进展[J].中国酿造,2014,33(12)：16～18.

[9]GuoYH,Yu-JinLI,Xin-YingWU,etal.Study ondecolorizinganddeodorizationofcodskinenzymolysis collagenpeptideliquid[J].ChinaFoodAdditives,2010.

[10]Jiu-HuMA.StudyonDeodorizationandDecolorizing TechnologyofKelp[J].JournalofAnhuiAgriculturalSciences, 2008,36(23)：10186～10005.

[11]冯伟伟,邹艳敏,茆广华等.人工养殖中华鲟鱼皮中胶原蛋白提取工艺研究[J].安徽农业科学,2012,40(25)：12653.

[12]郭兴凤.蛋白质水解度的测定[J].中国油脂,2000,25(06)：176～177.

[13]郭玉华,李钰金,吴新颖等.鳕鱼皮胶原蛋白肽酶解液脱色脱腥工艺的研究[J].中国食品添加剂,2010(04)：125～128.