光叶铁仔提取物对小菜蛾幼虫生长发育的影响

王学贵，余 婷，李 倩

(四川农业大学 农学院/无公害农药研究实验室，四川 成都 611130)

光叶铁仔提取物对小菜蛾幼虫生长发育的影响

王学贵，余 婷，李 倩

(四川农业大学 农学院/无公害农药研究实验室，四川 成都 611130)

【目的】研究光叶铁仔Myrsine stolonifera提取物对小菜蛾Plutella xylostella生长发育的影响。【方法】采用叶片载毒法，测定了光叶铁仔根、茎、叶甲醇提取物和大孔吸附树脂乙醇馏分对小菜蛾的生物活性；测定了大孔吸附树脂乙醇馏分对小菜蛾生长发育的影响。【结果】光叶铁仔根、茎、叶甲醇提取物和大孔吸附树脂乙醇馏分对小菜蛾具有胃毒作用，以叶部 50%(φ)乙醇馏分的效果较佳，72 h后校正死亡率达到75.56%。根茎部95%(φ)乙醇馏分与叶部50%(φ)乙醇馏分，对小菜蛾的幼虫具有一定的拒食作用与体质量抑制效果，其拒食率与体质量抑制率整体高于90%，且对化蛹及羽化有一定的影响。【结论】光叶铁仔提取物对小菜蛾幼虫具有较强的杀虫活性，其活性成分及作用机理值得深入研究。

光叶铁仔；提取物；小菜蛾；大孔吸附树脂；生长发育；拒食活性

化学农药的广泛使用在一定程度上缓解了农业害虫泛滥、粮食减产等问题，但长期单一使用易造成有害生物抗药性、农药残留等问题[1]。随着社会经济的发展，人们对食品质量与环境安全要求越来越高，对我国农药的生产和使用提出了更严格的要求[2]。2015年我国农业部提出到2020年农药零增长的行动方案，要求在控、替、精、统4个字上下功夫，其中“替”是关键，即用高效低剂量农药替代低效高剂量农药，绿色防控产品替代化学防治药剂等。因环保、低毒、易降解等特点，植物源农药已成为现代农业生产研究与应用的重点[3-4]。近年来，我国植物源农药的研究，尤其植物源杀虫活性的研究报道较多，如大青叶Folium isatidis的正丁醇和石油醚提取物对小菜蛾Plutella xylostella具有较强的毒杀作用[5]，雷霁等[6]发现曼陀罗Datura stramonium水提取物对小菜蛾表现出拒食及毒杀活性；郑如刚等[7]研究发现小桐子Jatropha curcas种子乙酸乙酯提取物对小菜蛾48 h校正死亡率达93.6%；Vanichpakorn等[8]研究发现藜芦Veratrum nigrum根乙酸乙酯、乙醇和丙酮提取物对小菜蛾幼虫均表现出杀虫活性，其中乙酸乙酯对小菜蛾2龄和3龄幼虫的LC50值分别为225和335 μg·mL–1。Cespedes等[9]从绉叶蒲包花菜Calceolaria integrifolia中提取的二萜、三萜和酚类物质对豆象Callosobruchus maculatus和墨西哥豆瓢虫Epilachna varivestis幼虫表现出很强的杀虫活性，在500 μg·cm–2用量下可致使豆象幼虫死亡率达到40%～81%，可致墨西哥瓢虫幼虫死亡率达到35.0%～88.9%。Pugazhvendan等[10]研究发现艾草Artemisia argyi正己烷提取物对赤拟谷盗 Tribolium castaneum的活性最强，72 h的校正死亡率达到58%，灰毛豆Tephrosia purpurea乙酸乙酯提取物杀虫活性次之，72 h的校正死亡率达到52%。植物源杀虫剂的活性成分除直接利用外，还可以作为合成新型杀虫剂的先导化合物，如氨基甲酸酯类和拟除虫菊酯类杀虫剂[1]、氯化烟酰类和鱼尼丁受体类杀虫剂[11]。

光叶铁仔Myrsine stolonifera为紫金牛科Myrsinaceae铁仔属Myrsine植物，是我国台湾、福建、浙江等地分布的一种常绿灌木[12]。前期研究表明，其甲醇提取物处理家蝇Musca domestica、蚜虫Aphidoidea、白纹伊蚊Aedes albopictus等均表现出较高的杀虫活性[13]，而鲜见其对小菜蛾Plutella xylostella的杀虫活性和生长发育的影响研究。本研究拟通过光叶铁仔甲醇提取物、大孔吸附树脂不同馏分对小菜蛾3龄幼虫的活性测定，初步明确其生物活性，以期为进一步开发利用光叶铁仔提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

小菜蛾为2011年由中国农业大学昆虫生理生化与分子毒理学实验室引种的敏感品系，以改良的蛭石萝卜苗法累代饲养至今，饲养条件为温度(25±1) ℃，相对湿度60%～70%，光周期为14 h光∶10 h暗，以3龄蜕皮后12 h幼虫为试虫。

光叶铁仔根、茎和叶于2011年9—11月采自重庆南川市金佛山国家自然风景保护区，由重庆市药用植物栽培研究所易思荣副研究员采集和鉴定。

丙酮、甲醇等试剂均为AR级。

1.2 方法

1.2.1 活性物质的提取 分部采集光叶铁仔根、茎和叶部材料，经干燥、粉碎分别得到60目粉末8.3、10.0和7.5 kg。采用冷浸法[11]，加入5倍体积的甲醇进行浸提，每次持续72 h以上，期间数次摇动，浸提3次，将提取液合并、浓缩，分别得到根、茎和叶部的甲醇提取物1 328、1 680和1 250 g。以D101大孔吸附树脂为载体，采用水及φ为30%、50%、70%和95%的乙醇对所得叶部和根茎甲醇提取物(根据成分初步判断，绝大多数成分相似，进行合并)进行洗脱，得到根茎部水层提取物15.03 g，根茎部φ为30%、50%、70%、95%的乙醇提取物分别为10.31、14.25、13.99和18.71 g；叶部水层提取物19.24 g、叶部φ为30%、50%、70%、95%的乙醇提取物分别为12.55、11.26、13.45和14.78 g。

1.2.2 活性物质对小菜蛾生长发育的影响 叶片载毒法[14]测定活性提取物对小菜蛾3龄幼虫生长发育的影响。称取光叶铁仔根、茎、叶甲醇提取物各0.1 g，用1 mL的丙酮溶解，用蒸馏水定容到20 mL，分别配成质量浓度为5 mg·mL–1的供试溶液；以丙酮溶液为空白对照，将新鲜甘蓝Brassica oleracea叶剪成直径2 cm的叶碟，浸入供试溶液中10 s后取出，晾干后放入滤纸保湿的塑料培养皿(9 cm× 9 cm)中，每皿放入4片处理叶碟，同时接入10头饥饿处理6 h的3龄幼虫，每个处理3次重复(在接入虫体之前称取每皿幼虫的总质量)，并在培养皿上覆盖一层用细针扎过适量小孔的保鲜膜，在(25±1)℃养虫室内饲养，每隔24 h更换用药叶碟。12、24、36、48、72 h后分别检查记录幼虫死亡情况，同时计算24和48 h的体质量抑制率。

1.2.3 活性物质对小菜蛾的拒食活性 根据文献[14]的方法测定甲醇提取物对小菜蛾3龄幼虫的非选择性拒食活性和选择性拒食活性。每一培养皿中放入2片处理叶碟和2片对照叶碟，交替放置，分别于24、48 h后用坐标方格纸测定剩余面积，并计算试虫拒食率：

式中，S对照、S处理分别表示对照和处理的取食面积。1.2.4 高馏分提取物对小菜蛾的生物活性 检测光叶铁仔叶部、根茎部分甲醇提取物经D101型大孔吸附树脂提取所得的水层馏分、30%(φ)乙醇馏分、50%(φ)乙醇馏分、70%(φ)乙醇馏分、95%(φ)乙醇馏分对小菜蛾的生物活性影响。参照1.2.2的方法，处理12、24、36、48、60、72 h后，记录各处理小菜蛾的死亡情况，同时记录24、48、72 h虫体质量及叶碟取食面积，计算校正死亡率、体质量抑制率和非选择拒食率，综合考虑各种结果，筛选出生物活性较高的1～2种馏分。

1.2.5 高馏分提取物对小菜蛾生长发育的影响 参照1.2.2的方法。准确称取生物活性较高的馏分各0.4 g，用1 mL丙酮溶解，再用w为0.1%的Triton X–100溶液定容到100 mL，分别配制出质量浓度为20.00、10.00、5.00、2.50、1.25 mg·mL–1的溶液；同时以φ为1%的丙酮溶液为空白对照。将新鲜洗净后的甘蓝叶剪成3 cm×3 cm的正方形，浸入供试液中10 s后取出，晾干后放入滤纸保湿的一次性塑料培养皿(9 cm×9 cm)中，每皿放1片处理叶碟，同时接入15头饥饿处理6 h的3龄幼虫，每个处理 2 次重复(在接入虫体之前准确称量每皿幼虫的总体质量)，每隔24 h更换叶碟，前72 h饲养用药叶碟，之后用新鲜叶碟饲喂。72 h前每隔12 h检查记录小菜蛾的死亡及发育情况，计算死亡率、校正死亡率、化蛹率和羽化率。

2 结果与分析

2.1 甲醇提取物对小菜蛾3龄幼虫的杀虫活性

表1为光叶铁仔甲醇提取物对小菜蛾3龄幼虫的胃毒作用结果，表2为光叶铁仔甲醇提取物对小菜蛾3龄幼虫生长发育的影响，从表1可以看出，光叶铁仔根、茎、叶甲醇提取物(5 mg·mL–1)对小菜蛾表现出一定的胃毒作用，其中以茎部甲醇提取物活性最强，且在72 h时显著高于叶部提取物活性(P＜0.05)。从表2可以看出，根部甲醇提取物对小菜蛾3龄幼虫24 h的体质量抑制率最大，达到34.77%，而在48 h后，所有处理的体质量抑制率均下降，但茎部甲醇提取物的体质量抑制率仍显著高于叶部甲醇提取物体质量抑制率(P＜0.05)。

表1 光叶铁仔甲醇提取物对小菜蛾3龄幼虫的胃毒作用1)Tab. 1 Stomach toxicity of methanol extracts against the 3rd instar larvae of Plutella xylostella

表2 光叶铁仔甲醇提取物对小菜蛾3龄幼虫的体质量抑制率Tab. 2 Body weight inhibition of methanol extracts against the 3rd instar larvae of Plutella xylostella

2.2 光叶铁仔甲醇提取物对小菜蛾3龄幼虫的拒食活性

表3为光叶铁仔甲醇提取物对小菜蛾3龄幼虫的拒食活性，从表3可以看出，光叶铁仔茎、根、叶部的甲醇提取物对小菜蛾3龄幼虫均表现出一定的拒食活性。在24 h时，茎部甲醇提取物的非选择性拒食率与选择性拒食率均最高，显著高于叶部甲醇提取物的拒食活性(P＜0.05)；在48 h时，各处理非选择性拒食作用进一步提高，但选择性拒食作用则略有下降，茎甲醇提取物的拒食活性显著高于叶部甲醇提取物拒食活性(P＜0.05)。综合上述结果，非选择拒食与选择性拒食效果表现为茎＞根＞叶。

表3 光叶铁仔甲醇提取物对小菜蛾3龄幼虫的拒食活性1)Tab. 3 Antifeedant effects of methanol extracts against the 3rd instar larvae of Plutella xylostella

2.3 D101型大孔吸附树脂不同馏分对小菜蛾3龄幼虫的胃毒和拒食作用

表4结果表明，不同馏分对小菜蛾3龄幼虫都具有一定的胃毒作用，处理后72 h时，以叶50%(φ)乙醇馏分的效果最佳，试虫的校正死亡率达到57.50%，根茎95%(φ)和70%(φ)乙醇馏分及叶70%(φ)乙醇馏分处理的校正死亡率均高于相应的30%乙醇馏分，但差异不显著，且与其他馏分差异不显著(P＞0.05)。

表4结果表明不同馏分对小菜蛾3龄幼虫都具有一定的拒食作用，以叶50%(φ)、70%(φ)乙醇馏分及根茎95%(φ)、70%(φ)乙醇馏分对3龄小菜蛾拒食作用明显，在24、48、72 h都达到90%以上，与其他部分馏分的差异显著(P＜0.05)。

表4 大孔树脂不同馏分对小菜蛾3龄幼虫的胃毒和拒食作用Tab. 4 Stomach toxicity and antifeedant effect of different fractions through macroporus resin against the 3rd instar larvae of Plutella xylostella

2.4 D101型大孔吸附树脂不同馏分对小菜蛾3龄幼虫生长的影响

从表5可以看出，叶50%(φ)、70%(φ)乙醇馏分以及根茎95%(φ)和70%(φ)乙醇馏分对小菜蛾3龄幼虫体质量抑制作用明显，叶50%(φ)与70%(φ)乙醇馏分的体质量抑制率在24、48、72 h时都超过了100%，结合相应的非选择性拒食率情况，用这些馏分处理幼虫后，幼虫基本没有进食，且随着时间的推移，部分幼虫死亡；处理后的幼虫与对照相比，其体长明显较短。综合考虑活性及试验材料的数量，选择根茎部95%(φ)乙醇馏分和叶部50%(φ)乙醇馏分进行后续研究。

表5 大孔树脂不同馏分对小菜蛾3龄幼虫体质量的抑制作用1)Tab. 5 weight inhibition effect of different fractions through macroporus resin against the 3rd instar larvae of Plutella xylostella

2.5 叶部50%(φ)乙醇馏分与根茎95%(φ)乙醇馏分对小菜蛾3龄幼虫的生物活性

从表6可以看出，叶部50%(φ)乙醇馏分与根、茎95%(φ)乙醇馏分随着质量浓度的下降，其胃毒作用逐渐降低，在72 h时，叶部50%(φ)乙醇馏分20和 10 mg·mL–1校正死亡率最高，且与其他处理差异显著(P＜0.05)。叶部50%(φ)乙醇馏分20 mg·mL–1处理小菜蛾3龄幼虫后，化蛹率和羽化率最低，均仅有4.44%，且与CK差异极显著(P＜0.01)。

表6 根茎部95%(φ)乙醇馏分与叶部50%(φ)乙醇馏分对小菜蛾 3 龄幼虫的生物活性1)Tab. 6 The effects of 95% ethanol fraction of root and stem extract, and 50% ethanol fractions of leaf extract on bioactivities of the 3rd instar larvae of Plutella xylostella

3 讨论与结论

近年来，有大量关于植物提取物作用于害虫的研究与报道，从植物中寻找新的杀虫活性物质是开发新型杀虫剂，克服或延缓害虫抗药性的有效途径之一[14]。目前，国内外已经商品化开发的杀虫植物包括除虫菊Pyrethrum cinerariifolium、鱼藤 Derris trifoliata、印楝 Azadirachta indica等[13]。本研究表明，光叶铁仔甲醇粗提取物对小菜蛾3龄幼虫表现出一定的胃毒作用、拒食作用和体质量抑制作用，部分处理存活率仅有60%，且体色发黑，与对照组的幼虫相比极其不正常，体质量抑制率超过100%，与陈培等[15]研究雷公藤 Tripterygium wilfordii 不定根提取物处理小菜蛾结果一致。Bandeira等[16]研究发现文定果Muntingia calabura花和果正己烷提取物对小菜蛾1龄幼虫毒力最强，其LC50值分别为0.61和1.63 μg·mL–1。果实提取物对化蛹影响最大，且果和花提取物均可延长幼虫发育历期2 d左右。光叶铁仔根茎95%(φ)乙醇馏分20 mg·mL–1对小菜蛾的胃毒作用虽不明显，但对其化蛹率、羽化率等都有一定的影响，叶50%(φ)乙醇馏分的胃毒作用比根茎95%(φ)乙醇馏分更高且差异显著，且抑制化蛹或羽化，小菜蛾出现畸形蛹，或后期部分蛹即使羽化，其成虫也出现畸形，导致羽化率降低。光叶铁仔提取物处理小菜蛾幼虫与近年来部分植物提取物表现出相似的效果[17]，胃毒作用不强，但拒食效果与体质量抑制效果较好，影响小菜蛾的化蛹与羽化。

本试验采用叶片载毒法，通过活性跟踪分离技术初步明确了光叶铁仔不同部位甲醇提取物、不同体积分数乙醇大孔吸附树脂馏分对小菜蛾3龄幼虫的生物活性，初步明确了光叶铁仔甲醇提取物对小菜蛾3龄幼虫的非选择与选择性拒食活性、体质量抑制活性，以及对小菜蛾幼虫生长发育的影响，对光叶铁仔作为植物源农药的后续研究与开发具有一定的指导意义。

[1]徐汉虹. 植物化学保护学 [M]. 4版. 北京: 中国农业出版社, 2007: 1.

[2]徐汉虹. 食品安全法下推动下的植物源农药[J]. 农药科学与管理, 2010, 31(8): 7.

[3]农业部种植业管理司. 农业部关于印发《到2020年化肥使用量零增长行动方案》和《到2020年农药使用量零增长行动方案》的通知[EB/OL]. 2015[2016-11-10]. http://www.moa.gov.cn/zwllm/tzgg/tz/201503/ t201503184444765.htm.

[4]高希武. 我国害虫化学防治现状与发展策略[J]. 植物保护, 2010, 36(4): 19.

[5]唐晓清, 王康才, 吴健. 大青叶对小菜蛾杀虫活性部位的初步筛选[J]. 江西农业学报, 2012, 24(3): 85-86.

[6]雷霁, 梁婷婷, 冉俊祥, 等. 曼陀罗水提取物对小菜蛾的拒食及毒杀活性[J] .西北农业学报, 2012 ,21(1): 175-179.

[7]郑如刚, 张宇博, 陈伟平, 等. 小桐子种子提取物对小菜蛾、家蝇杀虫活性初探[J]. 热带生物学报, 2012, 3 (1): 69-72.

[8]VANICHPAKORN P, DING W, CEN X X. Insecticidal activity of five Chinese medicinal plants against Plutella xylostella L. larvae[J]. J Asia-Pac Entomol, 2010, 13(3): 169-173.

[9]CESPEDES C L, LINA-GARCIA L, KUBO I, et al. Calceolaria integrifolia s.l. complex, reduces feeding and growth of Acanthoscelides obtectus, and Epilachna varivestis: A new source of bioactive compounds against dry bean pests[J]. Ind Crop Prod, 2016, 89: 257-267.

[10]PUGAZHVENDAN S R, RONALD R P, ELUMALAI K. Insecticidal and repellant activities of four indigenous medicinal plants against stored grain pest, Tribolium castaneum (Herbst) (Coleoptera: Tenebrionidae)[J]. Asian Pac J Trop Dis, 2012, 2(S1): 16-20.

[11]吴文君, 著. 植物杀虫剂苦皮藤素研究与利用[M]. 北京: 化学工业出版社, 2011: 2-4.

[12]张秀实, 吴征镒. 中国植物志[M]. 北京: 科学出版社, 1979: 125.

[13]王学贵. 珍珠莲和岩木瓜的化学成分及其生物活性[D].广州: 华南农业大学, 2009.

[14]吴文君. 植物化学保护实验技术导论[M]. 西安: 陕西科学技术出版社, 1988: 72-77.

[15]陈培, 李琰. 雷公藤组培产物的杀虫杀菌活性研究[J].西北植物学报, 2012, 32(10): 2116-2121.

[16]BANDEIRA G N, CAMARA C A G, DE MORAES M M, et al. Insecticidal activity of Muntingia calabura extracts against larvae and pupae of diamondback, Plutella xylostella (Lepidoptera, Plutellidae)[J]. J King Saud Univer-Sci, 2013, 25(1): 83-89.

[17]丁建海, 刘世巍, 刘立红, 等. 六盘山区15种植物提取物对小菜蛾的生物活性[J]. 江苏农业科学, 2010(1): 151-152.

【责任编辑 霍 欢】

Effects of Myrsine stolonifera extracts on growth and development of Plutella xylostella larvae

WANG Xuegui, YU Ting, LI Qian
(College of Agriculture, Sichuan Agricultural University/Biorational Pesticide Research Lab, Chengdu 611130, China)

【Objective】To study the effects of Myrsine stolonifera extracts on growth and development of Plutella xylostella larvae.【Method】The bioactivities of M. stolonifera root, stem and leaf methanol extracts, and ethanol fractions of methanol extracts through macroporous resin against P. xylostella were determined by disc leaf method. The effects of ethanol fractions of extracts through macroporous resin on P. xylostella growth and development were studied.【Result】The root，stem and leaf methanol extracts of M. stolonifera and ethanol fractions of extracts through macroporous resin displayed stomach toxicity against P. xylostella. The 50% ethanol fraction of leaf extracts had the strongest insecticidal activity with an adjusted mortality of 75.56% after 72 h. The 95% ethanol fractions of root and stem extracts and 50% ethanol fractions of leaf extracts showed strong antifeedant activities and growth inhibition effects against P. xylostella larvae, with the antifeedant rates and growth inhibition rates over 90%. The extracts affected pupation and eclosion of P. xylostella.【Conclusion】M. stolonifera extracts display strong insecticidal activities against P. xylostella larvae. The insecticidal ingredients and mechanisms should be further studied.

Myrsine stolonifera; extract; Plutella xylostella; macroporous resin; growth and development; antifeedant activity

S436.3

A

1001-411X(2017)05-0061-06

王学贵, 余婷, 李倩. 光叶铁仔提取物对小菜蛾幼虫生长发育的影响[J]. 华南农业大学学报, 2017, 38(5): 61-66.

2016-12-31 优先出版时间：2017-07-14

优先出版网址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20170714.0859.022.html

王学贵(1976—)，男，副教授，博士，E-mail: wangxuegui@sicau.edu.cn

国家自然科学基金(31101493)