肌注和口灌氟苯尼考在吉富罗非鱼体内的药代动力学

白 野，陈昆慈，单 奇，郑光明，尹 怡，刘书贵

(1.中国水产科学研究院珠江水产研究所，农业部热带亚热带水产资源利用与养殖重点实验室，农业部水产品质量安全风险评估实验室(广州)，广州 510380；2.上海海洋大学水产与生命学院，上海201306)

肌注和口灌氟苯尼考在吉富罗非鱼体内的药代动力学

白 野1,2，陈昆慈1，单 奇1，郑光明1，尹 怡1，刘书贵1

(1.中国水产科学研究院珠江水产研究所，农业部热带亚热带水产资源利用与养殖重点实验室，农业部水产品质量安全风险评估实验室(广州)，广州 510380；2.上海海洋大学水产与生命学院，上海201306)

通过肌内注射、口灌两种给药方式，研究氟苯尼考在罗非鱼体内的药物代谢动力学特征。把吉富罗非鱼(GIFTOreochromisniloticus)随机分成2组，控制水温在30 ℃，以15 mg/kg分别单剂量肌内注射、口灌给药。经高效液相色谱法(HPLC)测定血浆中氟苯尼考浓度，用WinNonlin药动学软件分析药动学参数。结果表明：肌内注射氟苯尼考后，药物吸收较慢，消除较快，达峰时间(Tmax)=4 h，峰浓度(Cmax)=4.64 μg/mL，消除半衰期(T1/2λzL)=10.45 h，药-时曲线下面积(AUC)=91.06 μg·h/mL。口灌氟苯尼考后，药物吸收较快，消除较慢，Tmax=1 h，Cmax=5.92 μg/mL，T1/2λzL =13.13 h，AUC=61.96 μg·h/mL。肌内注射、口灌氟苯尼考后，二者的药动学参数差异显著，这一差异表明肌内注射给药吸收相对较慢，但更为完全(肌内注射氟苯尼考的AUC明显较大)，消除相对较快。

氟苯尼考；吉富罗非鱼(GIFTOreochromisniloticus)；药代动力学；血浆；高效液相色谱法

氟苯尼考(florfennicol，FF)又称氟甲砜霉素，系甲砜霉素的单氟衍生物，属于动物专用的氯霉素类广谱抗生素。氟苯尼考在结构上以甲砜基-CH3SO2基团取代氯霉素的-NO2，使其不再产生再生障碍性贫血，极大降低了其对动物及人体的毒性；以F原子取代氯霉素中的α-甲基位上的-OH，避免其因细菌的乙酰化而失活，从而极大提高了自身的抗菌活性。因此许多对氯霉素、甲砜霉素耐药的细菌，对氟苯尼考依旧敏感。氟苯尼考具有相对吸收快、消除缓慢、组织分布广泛[1]等特点，对革兰氏阴性菌、阳性菌、支原体等均具较强的抑制作用。因而其取代氯霉素，自上世纪90年代始，在国内外水产养殖中得到广泛应用[2]。

近年来，在中华鳖(Pelodiscussinensis)[3]、克氏鳌虾(Procambarusclarkii)[4]、草鱼(Ctenpharyngodonidellus)[5]、鲫 (Carassiuscarassius)[6]等水生动物中开展了氟苯尼考不同给药方式的研究，但在罗非鱼方面鲜有报道。罗非鱼是联合国粮农组织推广养殖的种类之一，被誉为未来动物性蛋白质的主要来源[7]，2013年中国罗非鱼产量为165.77万吨。因此开展氟苯尼考在罗非鱼体内的药代动力学研究，为临床用药提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

吉富罗非鱼(Oreochromisniloticus)平均体重(350±50) g，抽样检查无氟苯尼考残留，购自珠江水产研究所养殖基地，暂养在水生实验动物房暂养池内，持续供氧并对水体进行循环过滤，利用微电脑智能温控器将水温控制在(30±1) ℃，驯养一个月。实验前禁食2 d，实验期间吉富罗非鱼成活率为100%。

1.1.2 药品与试剂

氟苯尼考原药(含量98%，珠江水产研究所药厂)；氟苯尼考标准品(含量99%，上海跃鹏公司)；氯霉素标准品(含量98.6%，北京振翔有限公司)；乙腈(色谱纯，霍尼韦尔贸易上海有限公司)；正己烷(色谱纯，韩国德山药品工业)；乙酸乙酯(分析纯，广州化学试剂厂)；N-N二甲基甲酰胺(分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司)、聚乙二醇S-400(分析纯，阿拉丁试剂(上海)有限公司)

1.1.3 实验仪器

高效液相色谱仪(Waters-e2695液相，2489紫外检测器)、氮吹仪(N-EVAP112)、高速冷冻离心机(AllegraTM64R)、涡旋仪(IKA○RMS 3 basic)、高速离心机(Sigma，1-15)、纯水机(Synergy UV)。

1.2 方法

1.2.1 药液的配制

称取10 mg氟苯尼考标准品于10 mL容量瓶中，用乙腈定容，配成质量浓度为1 000 μg/mL的标准储备液。

称取10 mg氯霉素标准品于10 mL容量瓶中，用乙腈定容，配成质量浓度为1 000 μg/mL的内标，然后用蒸馏水稀释成质量浓度为50 μg/mL的内标储备液。

氟苯尼考注射液为现配现用，准确称取1.5 g氟苯尼考于100 mL容量瓶中，加入1.5 mL N-N二甲基甲酰胺溶解、摇匀，之后再加入6 mL聚乙二醇S-400，摇匀后超声20 min，用生理盐水定容至100 mL，制成注射液。

1.2.2 给药及样品采集

选用400尾罗非鱼，随机分成2组，分别进行肌内注射、口灌(经口灌服，1mL无菌注射器准确抽取药物后通过加长型的大鼠灌胃针灌注到罗非鱼的食道中)给药，给药剂量为15 mg/kg bw。给药前采取一批空白样，然后在给药后的5 、10 、15 、30 、45 min及1、2、4、8、12、16、24、36、48、72、96、120、144、168 h于尾静脉采血2～3 mL，每个时间点采10尾鱼，每条鱼仅采一个血样，分别置于预先涂有1%肝素钠的离心管中，4 000 r/min离心15 min，分离血浆,置-20 ℃冷冻保存，待进行血药浓度的测定。

1.2.3 样品前处理

取500 μL血浆于15 mL离心管中，加入10 μL浓度为50 μg/mL的氯霉素内标。震荡摇匀1 min，加入2 mL乙酸乙酯，高速震荡10 min，之后6 000 r/min离心12 min，取上清液，重复提取一次，合并提取液于10 mL玻璃管中，40 ℃水浴中氮气吹干，残渣用500 μL流动相复溶，随后添加500 μL正己烷，涡旋2 min，13 000 r/min离心12 min后，弃上层有机相，下层经孔径为0.22 μm的一次性针式滤器过滤，之后注入液相进样瓶中待测。

1.2.4 色谱条件

流动相：乙睛-水(25∶75，v/v)；流速：1.0 mL/min ；色谱柱：Atlantis C18 色谱柱(4.6×250 mm，粒度5 μm)；柱温：30 ℃；紫外线检测波长：223 nm；进样体积：50 μL。

1.2.5 标准曲线与线性范围

取15 mL离心管9个，每个加入空白血浆450 μL，添加50 μL标液于对应的空白血浆中，使得添加后的血浆药物浓度为0.01、0.025、0.05、0.1、0.5、1、5、10、20 μg/mL，按1.2.3方法处理后进行检测，将氟苯尼考与氯霉素内标的色谱峰面积之比值(S)与相对应的药物浓度(C)作线性回归分析，用最小二乘法求得标准曲线方程和相关系数。

1.2.6 回收率和变异系数的测定

采用空白添加的方式，以0.01、1、10 μg/mL三个浓度梯度来考察回收率和精密度，每个浓度5个平行，且均做三个批次，按1.2.3方法处理后，进行检测。将氟苯尼考与内标的色谱峰面积之比值(S)代入氟苯尼考的标准曲线中，求出血浆中实测药物含量，回收率=(样品实测浓度/样品理论浓度)×100%

1.2.7 检测限(LOD)和定量限(LOQ)

取罗非鱼空白血浆样品，添加氟苯尼考标准液适量，使得氟苯尼考在血浆中的浓度分别为0.001、0.003、0.005、0.01、0.02 μg/mL。每个浓度5个平行，按1.2.3方法处理后，进行检测，以最低检测浓度计算，3倍信噪比(S/N)为检测限，10倍信噪比为定量限。

1.2.8 数据处理

将氟苯尼考在吉富罗非鱼体内各时间点的平均血药浓度-时间数据，用WinNolin 5.12药物动力学软件进行处理，计算相关药代动力学参数。

2 结果

2.1 线性范围

当罗非鱼血浆中氟苯尼考的浓度为0.01～20 μg/mL时，血液中氟苯尼考与内标氯霉素的色谱峰面积之比值(S)与相对应的药物浓度(C)有良好的线性关系，相关系数R2为0.999 9。标准曲线方程为C=1.841 3 S+0.004 8(图1)。

2.2 回收率和变异系数

血浆中三个浓度水平的药物回收率水平均在90%以上；批内和批间变异系数均小于8.5%，满足药物动力学实验分析要求。

2.3 检测限(LOD)和定量限(LOQ)

按信噪比S/N=3为检测限(LOD)，S/N=10为定量限(LOQ)。求得血浆样品中氟苯尼考的LOD为0.003 μg/mL，LOQ为0.01 μg/mL。

图1 氟苯尼考标准曲线Fig.1 The calibration curve of florfennicol

2.4 氟苯尼考在罗非鱼体内的药代动力学特征

在30 ℃水温条件下，氟苯尼考以15 mg/kg剂量肌内注射和口灌给药后。氟苯尼考在罗非鱼血浆中不同时间点的的平均药物浓度见表1；肌内注射和口灌氟苯尼考的药-时曲线见图2；应用WinNonlin药动学分析软件，所得药动学参数见表2。肌内注射氟苯尼考后，药物吸收较慢，消除较快，达峰时间(Tmax)为4 h，峰浓度(Cmax)为4.64 μg/mL，消除半衰期(T1/2λzL)为10.45 h，药-时曲线下面积(AUC)为91.06 μg·h/mL。口灌氟苯尼考后，药物吸收较快，消除较慢，Tmax为1 h，Cmax为5.92 μg/mL，T1/2λzL 为13.13 h，AUC为61.96 μg·h/mL。氟苯尼考在罗非鱼体内的药物代谢出现“双峰现象”。

表1 15 mg/kg进行单剂量肌内注射和口灌给药后， 罗非鱼血浆中氟苯尼考的血药浓度 (n=10)Tab.1 Florfennicol concentrations in O.niloticusplasma following a single intramuscular or oral dose of 15 mg/kg (n=10)

续表1

图2 罗非鱼单剂量肌内注射和口灌15 mg/kg 氟苯尼考后血浆中的药-时曲线图Fig.2 Concentration-time curve of florfenicol in plasma after single oral and intramuscular doses of 15 mg/kg in O.niloticus表2 在30 ℃水温条件下，以15 mg/kg单剂量肌内注射 和口灌给药后氟苯尼考在罗非鱼体内的药代动力学参数Tab.2 Pharmacokinetic parameters of florfenicol inO.niloticus following a single intramuscular or oral dose of 15 mg/kg at 30 ℃

参数单位肌内注射口灌λzh-10.0660.053T1/2λzLh10.4513.13Tmaxh4.001.00Cmaxμg/mL4.645.92AUCμg·h/mL91.0661.96Vd/FL/kg2.484.59CL/FL/(h·kg)0.160.24AUMCμg·h2/mL1520.95789.60MRTh16.7012.74

注：λz，为消除速率常数；T1/2λzL，消除半衰期；Tmax，达峰时间；Cmax，峰浓度；AUC，药-时曲线下面积；Vd/F，表观分布容积；CL/F，体内清除率；AUMC，为一阶矩时间曲线下面积；MRT，平均滞留时间

3 讨论

3.1 两种给药方式氟苯尼考在罗非鱼体内的药时曲线特征“双峰现象”

在30 ℃水温条件下，氟苯尼考两种不同方式，其药时曲线均具有明显的“双峰”特征：肌内注射第一次“低浓度达峰”时间为30 min，第二次达峰时间(Tmax)为4 h；口灌第一次“低浓度达峰”时间为30 min，第二次达峰时间(Tmax)为1 h。朱师[8]在对鲫的报道中，除了肝脏之外，其他组织中都有双峰现象的出现。冯敬宾等[9]在对罗非鱼的报道中，22 ℃组和28 ℃组分别在2～6、4～8 h药物浓度先略有下降，之后继续回升。潘红艳等[10]在对杂交鲟鱼的报道中，可见其血浆内有明显的双峰现象出现。秦方锦等[11]在对大黄鱼的报道中，肝脏药物在0.25 h迅速富集，随后浓度下降，在2～4 h再次达到峰值。本实验的结果与文献中的报道相似，“双峰现象”可能是肠肝循环[12]、多部位吸收[13]、药物制剂因素[14]、药物对胃肠的刺激[15]等导致。

3.2 氟苯尼考在罗非鱼体内的药物代谢动力学特征

罗非鱼肌内注射、口灌15 mg/kg氟苯尼考后，其在血浆中的达峰时间(Tmax)分别为4 h和1 h，表明肌内注射吸收较为缓慢；达峰浓度(Cmax)分别为4.64、5.92 μg/mL，两者差别不大；药-时曲线下面积(AUC)分别为91.06、61.96 μg·h/mL，所以肌内注射较口灌吸收完全；表观分布容积(Vd/F)均大于1.00 L/kg，表明药物在组织中的分布浓度大于血浆，组织中分布广泛(Vd/F：0.80～1.00 L/kg，药物在体内均匀分布，>1.00 L/kg，组织中的药物浓度大于血浆)；平均滞留时间(MRT)分别为16.70、12.74 h，表明肌内注射维持有效血药浓度的时间较长。结果表明，氟苯尼考在罗非鱼的疾病防治方面，肌内注射优于口灌。

本研究结果显示，肌内注射组(达峰时间)Tmax为4 h，与田丽等[16]在肌内注射牙鲆的报道中Tmax为6 h，Lim等[17]在肌内注射牙鲆的报道中Tmax为5.60 h相比，达峰速度较快。口灌组(达峰时间)Tmax为1 h，与张收元等[18]在口灌鲫的报道中Tmax为4.1 h，Gaunt等[19]在口灌斑点叉尾鮰的报道中Tmax为9.20 h相比，达峰速度亦较快。

肌内注射组、口灌组的(消除半衰期)T1/2λzL分别为10.45、13.13 h，Yanong等[20]在肌内注射锦鲤的报道中T1/2λzL为13.9 h，谢玲玲等[21]在口灌黄鳝的报道中T1/2λzL为10.84 h，Park等[22]在口灌韩国鲶的报道中T1/2λzL为15.69 h，本实验结果与文献中的报道相似。而林茂等[23]在对鳗鲡的报道中T1/2λzL为21.243 h，Samuelsen等[24]在对鳕(Gadousmacrocephaius)的报道中T1/2λzL为39 h，与本实验的研究结果存在一定差异，可能是由于水温、性别、种属等因素的差异引起的[25-26]。

3.3 氟苯尼考的给药方案及休药期的探讨

确定临床给药方案时，应重点考虑最小抑菌浓度(MIC)。氟苯尼考对多数病原菌均具有较高的药物敏感性，Samuelsen等[24]的研究显示，氟苯尼考对3株鳗弧菌的MIC值均为0.5 μg/mL。郭闯等[27]对14株致病的水生动物气单胞菌属细菌进行药物筛选，结果显示氟苯尼考对气单胞菌有最为显著的抑制作用，具有良好的应用前景。Michel等[28]报道氟苯尼考对黄杆菌属的MIC均为1 μg/mL。曹海鹏等[29]测定氟苯尼考对副溶血弧菌、嗜水气单胞菌、溶藻弧菌的MIC分别为0.5、1、2 μg/mL。本实验采用单剂量口灌给药、肌内注射，检测结果表明其在16 h以内的血药浓度分别维持在2.26、1.01 μg/mL，在此浓度下氟苯尼考可以有效杀灭大部分病原菌。因此，建议当以15 mg/kg单剂量给药时，给药间隔不超过24 h。

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(责任编辑：邓 薇)

Study on the pharmacokinetics of florfenicol in tilapia

BAI Ye1,2,CHEN Kun-ci1,SHAN Qi1,ZHENG Guang-ming1,YIN Yi1,LIU Shu-gui1

(1.KeyLaboratoryofTropicalandSubtropicalFisheryResourceApplicationandCultivationofMinistryofAgriculture/MinistryofAgricultureLaboratoryofQuality&SafetyRiskyAssessmentforAquaticProduct/PearlRiverFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademicofFisheryScience,Guangzhou510380,China;2.CollegeofFisheriesandLifeScience,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306,China)

To study the pharmacokinetics of florfenicol in,GIFTOreochromisniloticus,after intramuscular (i.m.) and oral administrations,the fish were divided into two groups for i.m.and oral administrations.Florfenicol was administrated to tilapia at a single dose of 15 mg/kg body weight at 30 ℃.The concentration of florfenicol in the plasma was determined by HPLC method.Pharmacokinetic parameters were calculated by noncompartment modeling provided by WinNonlin 5.12 software.The results show that the absorption of i.m.was slower while the elimination was faster,the time to peak plasma florfenicol concentration (Tmax) was 4 h,the maximum plasma concentration (Cmax) was 4.64 μg/mL,the elimination half-life (T1/2λzL) was 10.45 h and the area under the concentration-time curve (AUC) in plasma was 91.06 μg·h/mL.The absorption of oral administration was faster while the elimination was slower.The time to peak plasma florfenicol concentration (Tmax) was 1 h,the Cmaxwas 5.92 μg/mL,T1/2λzL was 13.13 h,and the AUC was 61.96 μg·h/mL.It suggested that the absorption of oral administration was faster than that of i.m.while the elimination was slower,and the i.m.administration absorbed more completely.

GIFTOreochromisniloticus;pharmacokinetics;plasma;HPLC

2016-03-18；

2017-03-06

国家自然科学基金项目(31502125)；广东省自然科学基金-博士启动基金项目(2015A030310086)；农业部水产品质量安全风险评估项目(GJFP201501001)

白 野，男，硕士，研究方向为水产品质量安全。E-mail: byxjl1989@163.com

郑光明。E-mail: zgmzyl1964@163.com

S948

A

1000-6907-(2017)04-0057-06