UHPLC法测定生鲜乳中黄曲霉毒素M1及M2

毛建霏，王加启郑楠文芳李松励雷绍荣，郭灵安，付成平，仲伶俐

（1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，农业部奶产品质量安全风险评估实验室（北京），农业部奶及奶制品质量监督检验测试中心（北京），动物营养学国家重点实验室，北京100193；2.四川省农业科学院分析测试中心;农业部农产品质量安全风险评估实验室(成都),成都610066）

UHPLC法测定生鲜乳中黄曲霉毒素M1及M2

毛建霏1,2，王加启1，郑楠1，文芳1，李松励1，雷绍荣2，郭灵安2，付成平2，仲伶俐2

（1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，农业部奶产品质量安全风险评估实验室（北京），农业部奶及奶制品质量监督检验测试中心（北京），动物营养学国家重点实验室，北京100193；2.四川省农业科学院分析测试中心;农业部农产品质量安全风险评估实验室(成都),成都610066）

建立了免疫亲和层析净化同时测定生鲜乳中黄曲霉毒素M1和M2的-超高效液相色谱（ultra high performance liquid chroma⁃tography，UHPLC）-荧光检测法。黄曲霉毒素M1仪器线性范围0.40～100 μg/mL，仪器定量限0.40 ng/mL，仪器检出限0.10 ng/mL，方法检出限0.005 μg/kg，回收率91.8%～96.8%；。黄曲霉毒素M2仪器线性范围0.10～100 μg/mL，仪器定量限0.10 ng/mL，仪器检出限0.03 ng/mL，方法检出限0.0015 μg/kg，回收率86.4至94.1%。两者的日内和日间变异系数均小于10%。使用该方法对来自成都市20个牧场的20个生鲜乳进行了测定，结果黄曲霉毒素M1的风险是安全可控的。此外除了黄曲霉毒素M1，还应加强黄曲霉毒素M2的监控。

超高效液相色谱；免疫亲和层析净化；黄曲霉毒素M1；黄曲霉毒素M2；生鲜乳

0 引言

黄曲霉毒素被国际癌症研究机构(IARC)列为1类致癌物[1-5]。黄曲霉毒素M1(AFM1)和M2(AFM2)分别为黄曲霉毒素B1和B2的羟基化代谢物[6-7]。当哺乳动物食用黄曲霉毒素污染的食物后，代谢物会分泌到乳汁中造成污染[8]。根据联合国粮食及农业组织(FAO)的数据,数十个国家已对牛奶及乳制品中的AFM1含量进行了严格规定[9]。虽然对AFM1的监测已经有大量报告[2,10-13],但对于牛奶中的AFM2的监测还很少[14-15]。目前已经有了普通液相色谱同时测定AFM1和AFM2的报告，但耗时较长，且并未对我国生鲜乳进行测定，缺乏目前我国生鲜乳AFM1和AFM2的数据[16,17]。本文采用超高效液相色谱法对生鲜乳中的AFM1和AFM2进行了准确快速的同时测定，并对成都市20个牧场的生鲜乳进行了检测，结果表明AFM1和AFM2的风险安全可控。

1 实验

1.1 仪器、试剂与材料

安捷伦1290超高效液相色谱仪：四元泵(G7104A)，自动进样器(G7167B)，柱温箱(G7116B)，荧光检测器(FLD,G1321B)。安捷伦化学工作站(版本C.01 07 SR1[13])。

色谱柱：Phenomenex Kinetex XB-C18,1.7 μm, 2.1 mm×100 mm。

黄曲霉毒素M1标液(10.0 μg/mL，溶于乙腈)；黄曲霉毒素M2标液(10.0 μg/mL，溶于乙腈)；甲醇(色谱纯)；乙腈(色谱纯)；实验用水均为超纯水；黄曲霉毒素M1免疫亲和柱(Clover)。

1.2 UHPLC条件

进样体积：10 μL，样品溶剂为50%甲醇/水溶液（体积比）；

流动相：25%乙腈/水溶液（体积比）等度洗脱，流速0.30 mL/min；

柱温：40℃；

荧光检测器波长：激发365 nm，发射435 nm；荧光检测器增益：12；

峰响应参数：峰宽＞0.05 min。

1.3 牛奶样品采集及前处理

生鲜乳使用无菌瓶采集后,立即与冰袋一起置于保温箱中带回实验室处理。称取50.0 g生鲜乳于离心管，4 500 r/min，4℃离心10 min，玻璃纤维滤纸过滤后以1～2滴每秒的速度将液体全部通过免疫亲和柱。用20 mL纯水以1～2滴每秒的速度清洗，挤干。用1.25 mL甲醇以2～3 s每滴的速度洗脱至空气进入，收集于试管。加入1.25 mL纯水涡旋混匀后，用0.22 μm孔径尼龙滤头过滤装瓶，待上机。

2 结果与分析

2.1 前处理方法选择

由于黄曲霉毒素在牛奶中的含量极低,需要采用准确灵敏的检测方法。免疫亲和柱净化方法目前仍然为常用的净化方法,能够从复杂基质中富集极低浓度的目标化合物,并具有极高的选择性[18]。过去对牛奶中霉菌毒素的关注主要集中在AFM1上，本研究发现，常用的AFM1免疫亲和柱可以同时对AFM2进行富集和净化。因此本研究采用AFM1免疫亲和柱作为样品前处理方法。洗脱时使用1.25 mL甲醇可以充分将待测物洗脱，直接加水稀释减轻溶剂效应，避免了繁琐的溶剂替换，大大提高了检测效率。

2.2 液相条件优化

使用近年来商品化的核壳填料色谱柱进行液相分离，相比传统全多孔填料，其具有更高的柱效[10,19-20]。使用乙腈-水或者甲醇-水均能够有效分离AFM1和AFM2。由图1可以看出，使用25%乙腈/水(图2a)和40%甲醇/水(图2b)体系可以获得相似的保留情况，但使用25%乙腈/水作为流动相可以获得更尖锐的峰形，从而提高灵敏度。因此使用25%乙腈/水作为流动相。对于高柱效的核壳填料色谱柱，采用梯度洗脱可以使峰高进一步增加，但考虑到灵敏度已经满足国内外严格限量要求并且25%乙腈/水作为流动相等度分析AFM1在国内外较为常用[21]，为节约分析时间，仍然采用等度洗脱方法。

图1 两种流动相体系分析AFM1和AFM2的UH⁃PLC-FLD色谱

荧光检测器属于浓度型检测器,在一定范围内,色谱峰的峰高随着进样量的增加而增加。在相同仪器条件下噪音水平相当，因此更高的峰高意味着更高的灵敏度。但过大的进样量容易造成色谱峰展宽,尤其是使用高柱效色谱柱和超高效液相色谱仪并存在溶剂效应的情况下。由图2可以看出，1～10μL进样体积时，峰高与进样量成正比，并且色谱峰没有明显展宽，当超过10μL进样体积时，色谱峰高增加不明显，并且峰宽开始明显增加。因此使用10μL进样体积。

图2 不同进样量情况下AFM1和AFM2的UHPLC-FLD色谱

2.3 方法验证

该分析条件下，在0.040～100 ng/mL质量浓度范围，AFM1质量浓度与峰面积具有良好的线性关系，线性回归方程y=3.2256x-0.1034，相关系数0.99999，y为峰面积，x为质量浓度；在0.010～100 ng/mL质量浓度范围，AFM2质量浓度与峰面积具有良好的线性关系，AFM2线性回归方程y=8.4493x-0.1089，相关系数0.99999。

在空白生鲜乳中添加3个不同质量分数（低、中、高3个质量分数0.02,0.1,0.4 μg/kg）的AFM1和AFM2进行回收率和精密度实验，每个质量分数6个平行样，在不同日重复测定2次，计算日内、日间变异系数，实验结果见表1。从表中可以看出，本方法AFM1在3个添加水平平均回收率范围在91.8至96.8%之间，变异系数范围在3.6%至6.1%之间，AFM2在3个添加水平平均回收率范围在86.4至94.1%之间，变异系数范围在3.8%至5.7%之间，均具有良好的正确度和精密度，同时可看出测定的误差与残留水平没有明显相关关系。

表1 AFM1和AFM2方法回收率和精密度实验结果%

图3为UHPLC-FLD色谱图。图3（a）中，AFM1对应信噪比为10时的仪器定量限为0.40 ng/mL，AFM2对应信噪比为10时的仪器定量限0.10 ng/mL。AFM1和AFM2对应信噪比为3时的仪器检出限分别为0.10 ng/mL和0.03 ng/mL。以取50 g样品最终定容至2.5mL计算，AFM1和AFM2方法定量限分别为0.005 μg/kg和0.0015 μg/kg。AFM1和AFM2的保留时间分别为1.85和2.31 min，相比传统HPLC在灵敏度显著提高的同时获得更好的色谱分离并显著缩短样品的仪器分析时间。

图3 UHPLC-FLD色谱

2.4 样品分析

使用该色谱方法对20个收集于成都市不同牧场和奶站的生鲜乳样品进行测定，含AFM10.31μg/kg和AFM20.018μg/kg的典型生鲜乳样品的色谱图如图3（b）所示，AFM1和AFM2获得快速分离，峰型良好并且无干扰峰。20个样品AFM1检出率65%，最大值0.31μg/kg,平均值0.026μg/kg,远低于国家限量值；AFM2检出率65%，最大值0.018μg/kg，平均值0.0031μg/kg，含量为AFM1的1/8左右。

3 结论

本文建立了同时测定生鲜乳中黄曲霉毒素M1和黄曲霉毒素M2的免疫亲和层析净化-超高效液相色谱法，具有良好的灵敏度、准确度和精密度。通过对20个收集于成都市不同牧场和奶站的生鲜乳样品进行测定发现，黄曲霉毒素M1和黄曲霉毒素M2的存在是比较普遍的(检出率均为65%)。两者的平均含量和最大值均远低于国家标准。总之，分析结果表明目前成都市生鲜乳中黄曲霉毒素M1和黄曲霉毒素M2的风险是安全可控。此外，有必要增加对AFM2的监测，以免造成风险的低估。

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Quantification of aflatoxin M1and aflatoxin M2in raw milk with UHPLC

MAO Jianfei1,2,WANG Jiaqi1,ZHENG Nan1,WEN Fang1,LI Songli1,LEI Shaorong2, GUO Lingan2,FU Chengping2,ZHONG Lingli2
(1.Institute of Animal Science of Chinese Academy of Agricultural Sciences,Ministry of Agriculture Laboratory of Quali⁃ty&Safety Risk Assessment for Dairy Products(Beijing),Ministry of Agriculture-Milk and Dairy Product Inspection Center(Beijing),State Key Laboratory of Animal Nutrition,Beijing 100193,China;2.Analysis and Testing Center of Si⁃chuan Academy of Agricultural Science;Laboratory of Quality&Safety Risk Assessment for Agro-products(Chengdu), Ministry of Agriculture,Chengdu,610066,China)

An ultra high performance liquid chromatography with fluorescence detection(UHPLC-FLD)after immunoaffinity column puri⁃fication has been developed for the simultaneous determination of AFM1and AFM2in raw milk.The linear range of AFM1is 0.40～100 μg/ mL and the instrumental limits of quantification and determination are 0.40 ng/mL and 0.10 ng/mL,respectively.The limit of determination of method is 0.005 μg/kg and the average recoveries were 91.8%～96.8%for AFM1.The linear range of AFM2is 0.10～100 μg/mL and the in⁃strumental limits of quantification and determination are 0.10 ng/mL and 0.03 ng/mL,respectively.The limit of determination of method is 0.0015 μg/kg and the average recoveries were 86.4%～94.1%for AFM2.Inter and intra day CVs were lower than 10%for both AFM1and AFM2.The proposed sensitive UHPLC-FLD method was applied to 20 raw milk samples collected from 20 different pastures in Chengdu. As the results indicate,the contamination level of AFM1is quite safe.Besides,AFM2should also be routinely monitored along with AFM1.

immunoaffinity column purification;UHPLC;Aflatoxin M1;Aflatoxin M2;raw milk

TS252.7

：A

：1001-2230（2017）06-0045-04

2016-12-31

国家奶产品质量安全风险评估重大专项(GJFP2016008002)；公益性行业（农业）科研专项(201403071)；四川省农业科学院优秀论文基金2014LWJJ-010；2016年“西部之光”访问学者项目。

毛建霏（1983-），男，硕士研究生，从事农产品质量安全风险评估工作。

郑楠