格列美脲对高脂饮食ApoE-/-小鼠骨微结构的影响

柳辰玥 赵保胜 刘海霞 朱如愿 王丽丽 马如风 李琳 陈贝贝 顾小盼 潘勃 吴臻 张东伟

1.北京中医药大学中药学院，北京 100102 2.北京中医药大学北京中医药研究院，北京 100029 3.北京中医药大学基础医学院，北京 100029 4.北京中医药大学糖尿病研究中心，北京 100029

骨质疏松是一种以骨量降低、骨微结构破坏为特征，并致骨脆性增加，易于发生骨折的慢性代谢性骨骼疾病[1]，受遗传和环境因素共同影响[2]。研究发现，ApoE-/-小鼠给予高脂饲料饲养一段时间后，骨形成减少和骨吸收增加，骨吸收和骨形成动态平衡被打破[3]，骨量明显减少[4-7]，造成骨质疏松。

临床研究也发现，服用磺脲类降糖药的患者骨折发生率降低[8]，但关于磺脲类降糖药对高脂饮食患者骨重建的影响及其作用机理，目前尚无详细报道。因此，本实验以高脂饮食造成ApoE-/-小鼠骨质疏松为对象，探索格列美脲对其骨微结构和骨生物力学的影响及可能的作用机理。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1主要仪器：Olympus BX53 倒置荧光显微镜，日本Olympus公司。RM2255 Leica轮转式切片机，德国Leica公司。博勒飞质构仪CT3，美国Brookfield公司。

1.1.2药品与试剂：格列美脲片，赛诺菲(北京)制药有限公司，批号：4JB061。乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)，北京市化学试剂公司。Fast Green，美国Sigma公司。Safrain O，美国Sigma公司。骨组织抗原修复液，上海舜百生物科技有限公司。免疫组化试剂盒，北京中杉金桥生物公司，批号：K152411A。DAB显色试剂盒，北京中杉金桥生物公司，批号：K166913B。Cathepsin K(ab19027)，Abcam公司。

1.1.3实验动物：SPF级C57BL/6和ApoE-/-小鼠，体重18～20 g，购自于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2012-0001，并饲养于北京中医药大学科研实验中心清洁级动物实验室，合格证号：SCXK(京)2011-0024，室温22 ℃，相对湿度55%，光暗周期12 h/12 h，自由饮水、饮食，适应性饲养7 d后开始实验。

1.2 方法

1.2.1分组及给药：实验时分别采用C57BL/6和ApoE-/-小鼠。其中，8 只野生型 C57BL/6 小鼠为野生正常组，ApoE-/-小鼠24只，按体质量随机分为ApoE-/-正常组、ApoE-/-高脂组和格列美脲组，每组8只。ApoE-/-高脂组和格列美脲组小鼠给予高脂饮食(含75%基础饲料，2%胆固醇，23%猪油)，野生正常组和ApoE-/-正常组给予普通饲料。格列美脲组灌服格列美脲(25 mg/kg)水溶液，其余各组分别给予等量去离子水。

1.2.2取材及样品制备：给药6周后，用1%戊巴比妥钠(4 mL/kg)腹腔麻醉处死小鼠，分离两侧股骨，剔除肌肉组织，其中一侧股骨用蘸生理盐水的纱布包裹，放于-80 ℃备用。将另一侧的股骨置于10%中性福尔马林，固定72 h后，15% EDTA(pH 7.4)脱钙，脱钙液每2周换1次，连续脱钙3个月。股骨组织脱钙后，自来水冲水过夜，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，采用Leica切片机进行组织切片，厚度为5 μm，40 ℃温水展片，60 ℃烘干，4 ℃保存待用。

1.2.3指标检测

(1) H&E染色：按照郭鱼波等[1]的染色方法：将股骨切片常规脱蜡至水，苏木素染色7 min，自来水冲洗，分色液分色1 min，去离子水浸洗，伊红染色3 min，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片后置于Olympus BX53倒置显微镜下观察病理形态并拍照。

(2) Safrain O/Fast Green染色：参考马如风等[9]的方法，简述如下：将股骨石蜡切片60 ℃烤片2 h，常规脱蜡至水，苏木素染色5 min，自来水冲洗3 min，1% HCl-Alc分化2 s，去离子水洗3次，0.05% Fast Green染5 min后用1%醋酸洗30 s，0.1% Safrain O染5 min后用95%乙醇洗3次，100%乙醇洗2次，二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明各30 min，中性树胶封片后拍照并用Image pro plus 6.0分析，计算灰度值(IOD)。

(3) 骨生物力学的测定：采用博勒飞质构仪CT3测定骨生物力学。实验时使股骨生理弯曲向上放置于跨距为7 mm的两个支撑点上，进行3点弯曲测试，探头下降速度为10 mm/min，至股骨断裂后继续运行2 mm停止，根据探头下降的距离、载荷以及骨断端直径，计算股骨的第一循环硬度、峰值压力和硬度形变量。

(4) 免疫组化测股骨Cathepsin K表达量：参考王丽丽等[10]的方法，简述如下：将股骨石蜡切片60 ℃烤片2 h后常规脱蜡至水，然后滴加骨组织抗原修复液，37 ℃孵育30 min后，依次滴加3% H2O2，0.04% Triton×100，10%山羊血清封闭后，加一抗Cathepsin K(比例1:50)，4 ℃孵育过夜。加免疫组化二抗37 ℃孵育30 min后，PBS洗3次，DAB显色，自来水冲洗，苏木素复染后自来水冲洗，脱水、透明，中性树胶封片，显微镜下观察拍照并用Image pro plus 6.0分析，计算IOD值。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 格列美脲对高脂饮食小鼠骨微结构的影响

由图1可知，H&E染色镜下观察，野生正常组小鼠骨骺端骨小梁排列整齐。与ApoE-/-正常组相比，ApoE-/-高脂组小鼠骨骺端稀疏，骨小梁排列紊乱、变细、断裂。与ApoE-/-高脂组小鼠相比，格列美脲组小鼠骨微结构得到改善，骨小梁排列整齐、增粗，但仍然未恢复到正常状态。

图1 小鼠股骨H&E染色 (×100)Fig.1 H&E staining of femurs in mice (×100)

如图2所示，在Fast Green染的绿色背景上，Safrain O把糖胺聚糖染成红色。野生正常组小鼠骨骺端糖胺聚糖含量多且分布均匀。与野生正常组小鼠相比，ApoE-/-正常组小鼠股骨糖胺聚糖含量无明显差异，ApoE-/-高脂组小鼠股骨糖胺聚糖含量显著减少(P<0.01)。与ApoE-/-高脂组相比，格列美脲连续治疗6周后，股骨糖胺聚糖含量明显增加(P<0.01)。

图2 Safrain O/Fast Green 染色与野生正常组比,# P<0.05,## P<0.01；与ApoE-/-高脂组比，*P<0.05, ** P<0.01Fig.2 Safrain O/Fast Green Staining #P <0.05,##P<0.01 vs WTN;*P<0.05, **P<0.01 vs ApoE-/- HFD

2.2 格列美脲对高脂饮食小鼠骨生物力学影响

如图3所示，与野生正常组小鼠相比，ApoE-/-正常组小鼠股骨第一循环硬度、峰值压力和硬度形变量均无明显改变，ApoE-/-高脂组小鼠股骨第一循环硬度、峰值压力和硬度形变量均显著降低(P<0.05或0.01)；与ApoE-/-高脂组相比，经格列美脲连续治疗6周后，第一循环硬度、峰值压力和硬度形变量均明显升高(P<0.05或0.01)。

图3 格列美脲对骨生物力学影响与野生正常组比,# P<0.05,##P<0.01；与ApoE-/-高脂组比，*P<0.05, **P<0.01Fig.3 Effect of Glimepiride on bone microarchitecture #P <0.05,##P<0.01 vs WTN;*P<0.05, **P<0.01 vs ApoE-/- HFD

2.3 格列美脲对高脂饮食小鼠的股骨Cathepsin K表达量的影响

研究证明，Cathepsin K与破骨细胞活性密切相关，且多在破骨细胞中表达[11]。本实验结果如图4所示，与野生正常组小鼠相比，ApoE-/-正常组和ApoE-/-高脂组小鼠骨骺端Cathepsin K表达量均升高(P<0.05，0.01)；与ApoE-/-高脂组相比，格列美脲组小鼠骨骺端Cathepsin K的表达量降低(P<0.05)。

图4 免疫组化染色测定小鼠股骨Cathepsin K的表达蓝色圈出部分为阳性表达，箭头所指部分为400倍放大的对应位置与野生正常组比,# P<0.05,## P<0.01；与ApoE-/-高脂组比，* P<0.05, ** P<0.01Fig.4 Immunohistochemical staining showed Cathepsin K expression in mice femurs, the part of blue circle was positive expression, the arrow pointing part is the corresponding position of x400 magnified#P<0.05,##P<0.01 vs WTN;*P<0.05, ** P<0.01 vs ApoE-/- HFD

3 讨论

遗传因素是骨质疏松发生的重要因素，多项遗传基因被视为骨质疏松的候选基因，载脂蛋白E(ApoE)基因是其中之一[2]。本实验中发现，高脂饮食诱发ApoE-/-小鼠骨量减少，说明高脂可诱导ApoE-/-小鼠骨质疏松。本实验结果显示高脂饮食导致ApoE-/-小鼠的骨微结构破坏，骨生物力学性能下降，骨强度下降，骨吸收增强。

格列美脲是第三代磺酰脲类降糖药，有研究表明，格列美脲可以促进成骨细胞分化[12]。本实验研究表明，格列美脲连续治疗6周，可以促进高脂喂养的ApoE-/-小鼠骨量增加，骨微结构改善，宏观上表现为骨第一循环硬度、峰值压力、硬度形变量，改善骨生物力学性能。Safrain O/Fast Green染色可以看出：高脂组小鼠骨组织中，糖胺聚糖含量减少，而格列美脲逆转了这种改变，促进了糖胺聚糖生成，从而促进骨形成。

Cathepsin K是一种溶酶体半胱氨酸蛋白酶，可以降解骨基质蛋白，其主要在破骨细胞中表达[13]。研究证明，Cathepsin K与破骨细胞活性密切相关，Cathepsin K表达越多，破骨细胞活性越强，从而促进骨吸收，因此，抑制Cathepsin K活性可改善骨质疏松[11]。本实验结果可以看出，格列美脲连续治疗6周后Cathepsin K表达量增多。本实验研究证明，高脂饲料喂养的ApoE-/-小鼠经格列美脲连续治疗6周后，骨骺端Cathepsin K表达降低，推测格列美脲可以抑制骨吸收，从而使骨吸收和骨形成达到平衡，向成骨方向转变，其机制可能与抑制Cathepsin K的表达有关。

总之，本研究结果表明，高脂饮食诱导ApoE-/-小鼠产生骨质疏松，经格列美脲连续治疗6周后，骨微结构得到改善，骨小梁排列整齐，骨强度增加，骨吸收降低，骨质疏松得到明显改善，其作用机制可能与抑制Cathepsin K的表达有关。