卵巢切除大鼠在不同时期RANKL、OPG蛋白表达的变化及与BTMs的相关性

林海鸣 黄云梅 吴银生 黄美雅 陈翔 刘振涛 林燕萍

福建中医药大学，福建 福州 350122

绝经后骨质疏松(PMOP)发病的主要原因是由于绝经后妇女卵巢功能下降，特别是雌激素的缺乏，导致骨吸收作用增强，造成快速骨丢失所引起。PMOP的发生与骨代谢失衡密切相关，目前研究表明OPG/RANKL/RANK轴是影响骨代谢的重要途径，许多研究工作基于该轴从骨代谢入手对PMOP的发生机制进行探讨，但目前对OPG/RANKL/RANK轴与骨代谢关系的研究尚未完全阐明[1]，有待更深入的研究。课题组在既往工作中已对去卵巢大鼠骨代谢标志物的变化进行了实验研究[2]，并基于OPG/RANK/RANKL轴做了对成骨细胞OPG、RANKLmRNA表达的探讨[3]。由于PMOP是一进展性疾病，有必要在实验中进行动态观测，目前基于该轴动态检测相关蛋白表达与骨代谢指标关系的研究较少见报道，因此本研究拟对不同时期RANKL、OPG蛋白表达的变化及与BTMs(骨转换标志物)的相关性做一初步的探讨。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1实验动物：3月龄雌性SD大鼠48只，SPF级，体重(267±21)g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，动物许可证号：SCXK(沪)2012-0002，合格证编号：2015000517533。在福建中医药大学动物实验中心鼠类实验室饲养，医学实验动物环境设施为SPF级(合格证号：SYXK (闽)2014-0005)。

1.1.2主要试剂：兔抗大鼠RANKL一抗(武汉博士德公司)，兔抗大鼠OPG一抗(SAB公司)、辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠、兔IgG(Earthox LLC公司)，一、二抗稀释液(碧云天生物技术研究所)，ECL发光试剂(Thermo Scientific公司)，SDS-PAGE凝胶配置试剂盒(碧云天生物技术研究所)，RIPA裂解液(南京诺唯赞公司)，BGP、CTX-I、BALP和TRAP-5b Elisa试剂盒(上海西唐公司)，PVDF膜(Invitrogen公司)。

1.1.3主要仪器设备：AIR TECH无菌操作台(苏净集团安泰公司)，64R低温高速离心机(美国Beckman公司)，MILLI-Q超纯水装置(美国Milipore公司)，Du650紫外分光光度计(美国Beckman公司)，Trans-Blot Turbo蛋白转印系统(美国BIO-RAD公司)，ChemiDocXRS+化学发光成像系统(美国BIO-RAD公司)。

1.2 实验方法

1.2.1动物分组及处理：48只3月龄SD雌性大鼠随机分成Sham组和OVX组，每组各24只。OVX组行双侧卵巢切除术：用2%戊巴比妥钠按40 mg/kg进行腹腔注射麻醉，行腹部正中切口，沿子宫双侧探及左、右卵巢，卵巢结扎切除术后腹壁逐层缝合。术后3 d连续肌注青霉素预防感染(8万单位/只)；Sham组未切除卵巢，其余步骤与OVX组同。

1.2.2取材：于术后第2、6、10、14周分批进行取材，每批次每组各取6只。大鼠以10%水合氯醛麻醉后，经腹主动脉采血，全血室温静置2 h后，经3 000 r/min离心20 min，取血清，1.5mLEP管分装，-80 ℃冻存，用于血清相关指标检测。取大鼠腰椎，其中L5、L6置于1.5mLEP管，-80 ℃冻存，用于骨组织OPG、RANKL蛋白检测。骨组织取材时，均在取材中及时放入液氮中暂存。

1.2.3指标检测：Western blot检测各时期大鼠骨组织的OPG、RANKL蛋白表达：取大鼠L5、L6提取骨组织蛋白，BCA法检测蛋白浓度，进行SDS-PAGE电泳后切胶，然后将胶上蛋白转印至PVDF膜，经封闭后一抗孵育过夜。次日孵二抗后，加ECL化学发光试剂，在化学发光成像系统上显影。Image Lab图象分析软件分析目的条带，读取并记录每条带的光密度值。Elisa检测各时期大鼠血清骨转换标志物BGP、BALP、CTX-I、TRAP-5b的变化。分别按相应Elisa试剂盒说明进行检测，最后酶标仪读取OD值，并计算各标志物水平。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 OPG、RNAKL蛋白表达

Western blot检测不同时期大鼠L5、L6骨组织的OPG、RNAKL蛋白表达，与Sham组比较，OVX组在术后各时期骨组织RANKL蛋白表达均升高，第2周(P<0.01)和第10、14周(P<0.05)有统计学意义，OPG蛋白表达在第2周(P<0.01)和第6周(P<0.05)显著降低。见图1、2。

图1 大鼠骨组织RANKL、OPG的Western Blot结果Fig.1 Western Blot results of RANKL and OPG in rat bone tissue

图2 大鼠骨组织RANKL、OPG蛋白表达相对量结果比较注：与Sham组比较，* P<0.05，** P<0.01Fig.2 Comparison of the relative expression of RANKL and OPG in rat bone tissueNote:Compared with Sham group,*P<0.05,**P<0.01

2.2 血清骨转换标志物BGP、BALP、CTX-I、TRAP-5b水平

Elisa检测不同时期大鼠血清骨转换标志物BGP、BALP、CTX-I、TRAP-5b水平，与Sham组比较，术后第2周OVX组TRAP-5b水平显著升高(P<0.01)，BGP、BALP、CTX-I水平显著升高(P<0.05)；术后第6周OVX组BGP、BALP水平显著升高(P<0.01)，CTX-I水平显著下降(P<0.05)、TRAP-5b水平显著下降(P<0.01)；术后第10周及第14周OVX组CTX-I水平显著升高(P<0.05)，BALP水平显著升高(P<0.01)。见图3。

2.3 骨组织OPG、RANKL蛋白表达与骨转换标志物的相关性

BTMs数据不符合正态分布，采用Spearman检验，相关性分析显示骨组织RANKL与血清CTX-I、TRAP-5b水平成正相关(P<0.05)，骨组织OPG与血清CTX-I、TRAP-5b水平成负相关(P<0.01)。见表1。

3 讨论

骨代谢标志物可分为一般生化标志物、骨代谢调控激素和骨转换标志物3类，PMOP是高转换型骨质疏松症，本实验选择骨转换标志物(BTMs)为检测指标，包括骨形成标志物BGP、BALP，骨吸收标志物CTX-I、TRAP-5b。

表1 骨组织RANKL、OPG与血清骨转换标志物的相关性分析Table 1 Correlation analysis between serum BTMs and RANKL and OPG of bone tissue

注：*在0.05水平(双侧)上显著相关，**在0.01水平(双侧)上显著相关。
Note:*Significant correlation at 0.05 level(bilateral),**Significant correlation at 0.01 level(bilateral).

图3 不同时期大鼠血清骨转换标志物(BGP、BALP、CTX-I、TRAP-5b)变化的比较注：与Sham组比较，* P<0.05，** P<0.01Fig.3 Comparison of BTMs (BGP, BALP, CTX-I and TRAP-5b) in serum of rats at different periodsNote:Compared with Sham group,*P<0.05,**P<0.01

TRAP-5b是由破骨细胞产生的非胶原蛋白，是早期反映破骨细胞活性的标志物[4]，血清TRAP-5b与骨吸收水平呈正相关；CTX-I是I型胶原的降解产物，是反映骨吸收的特异性指标。本实验显示OVX组术后2周TRAP-5b显著升高，提示卵巢切除后骨吸收增强，但该指标在后期(10、14周)无显著性差异，而CTX-I在第2、10、14周OVX组均较Sham组显著升高，持续时间较长，可能与骨组织的构成有关，骨有机成分主要是由I型胶原组成，当骨吸收增强时I型胶原降解较正常增多，降解产物增加，CTX-I升高，且CTX-I有骨I型胶原分子间交联物的重要区段和近似交联物的残基，其紧密结构可以保护不受肝、肾的进一步降解，具有较好的稳定性[5]，因此在术后第10、14周组间仍有显著性差异。实验中TRAP-5b的早期升高及CTX-I术后第2、10、14周的升高均提示，卵巢切除后由于雌激素水平下降，导致骨吸收增加，但在第6周TRAP-5b、CTX-I有阶段性的下降，结合骨形成标志物BALP及BGP的结果(第6周BALP、BGP水平OVX组较Sham组高)，提示可能是快速骨丢失后的暂时的某种机制的骨吸收抑制。

BALP由成骨细胞分泌，在骨矿化过程中，将单磷酸酯水解成无机磷，增加局部无机磷的浓度，水解焦磷酸盐，解除其对骨盐形成的抑制作用，是成骨细胞成熟和具有活性的标志，是骨形成的特异及敏感标志物[5]；BGP是成骨细胞功能和骨质矿化的特殊标志物，由成骨细胞合成类骨质时释放到细胞外基质，其中一小部分进入血液循环，因此血清中BGP水平变化，是直接反映骨形成的一种特异性指标，当骨基质降解时其中的BGP也进入血液循环中，因此BGP除了能反映成骨细胞的活性，在更大程度上反映的是骨转换[6]。本实验BALP检测结果稳定，各时期水平总体呈升高趋势，各时期OVX组均较Sham组显著升高，提示卵巢切除大鼠继发的骨形成增强。BGP水平在各时期OVX组均较Sham组升高，在第2、6周有显著性差异，同样提示卵巢切除大鼠的骨代谢活跃，骨转换性提高。

以上显示，卵巢切除大鼠骨转换标志物随时间推移呈动态变化，骨吸收标志物TRAP-5b在卵巢切除早期即有显著的升高，而CTX-I总体升高、有阶段性下降，升高持续时间更长，总体表现为以骨吸收增强为主的高转换性骨代谢的特点。变化有显著性差异的骨转换标志物随术后时间的延长呈下降趋势，在第2、6周各标志物均有显著性差异，到第14周仅BALP、CTX-I差异有统计学意义，可能是机体对早期快速骨吸收的一定程度的代偿机制的作用。

OPG/RANKL/RANK系统是雌激素调节破骨细胞生成和抗骨吸收作用的重要途径之一[7]，雌激素可抑制破骨细胞的分化、成熟及活性，从而抑制骨吸收，雌激素缺乏可促进OC形成、分化及增强其活性，这一过程与OPG、RANKL关系密切，实验中OVX组骨组织RANKL表达较Sham组在第2、6周均升高，第2周有显著性差异，而OPG表达显著下降，导致同时期OVX组的RANKL/OPG比值显著升高，显示由于雌激素水平下降导致成骨细胞过度表达RANKL而降低OPG的表达，使RANKL与RANK结合，启动OC的分化和功能活性，骨吸收过度活跃，切除卵巢早期过度表达RANKL而降低OPG表达的结果与之前一些学者的研究结果一致[8]。相应的骨转换标志物TRAP-5b、CTX-I在第2周升高，进入骨量快速丢失阶段，文献资料也显示大鼠在去卵巢后3周和6周，骨量下降较显著，12周之后骨量持续平稳下降[9]。但在第6周OVX组TRAP-5b、CTX-I出现阶段性下降，可能是机体的某种负反馈机制抑制骨吸收。有研究发现RANKL诱导表达的LGR4可做为负反馈信号抑制破骨细胞的分化与功能[10]，实验中OVX组RANKL早期的显著高表达可能通过类似的机制暂时抑制OC活性，以应对机体由于雌激素缺乏引起的快速骨量丢失。在第10、14周OVX组RANKL仍高表达，同期CTX-I均显著升高，提示骨吸收持续增强，而BALP水平的显著上调，提示伴随成骨细胞活性增强，骨形成增加，但由于骨吸收强于骨形成，而导致骨质疏松症的发生。相关性分析显示骨转换标志物CTX-I、TRAP-5b与骨OPG成负相关，与骨RANKL成正相关。

本实验取材受到实验动物的限制，无法连续多次大量采血和提取骨组织标本，使动态观察的连续性受到限制，有待加大样本、改进实验进一步研究。