中国汉族人群白癜风6q27区域易感基因精细定位研究

高 敏 李增刚 郑晓东 周伏圣 唐先发



·论著·

中国汉族人群白癜风6q27区域易感基因精细定位研究

高 敏 李增刚 郑晓东 周伏圣 唐先发

目的： 对中国汉族人群白癜风6q27易感区域进行精细定位研究，以期发现白癜风易感基因。方法： 收集2942例白癜风患者和2850名正常对照标本，对6q27易感区域内的24个标签SNP位点进行基因分型。采用Plink 1.07和SPSS19.0软件进行统计分析,同时进行条件回归分析和连锁不平衡分析。结果： (1)SNP位点rs2236313、rs9457258、rs720325、rs968334、rs3093025、rs55802221、rs1012656、rs6930998和rs1331299的等位基因频率在病例组和对照组之间具有显著差异，但是通过条件回归分析结果提示没有新的独立信号存在；(2)连锁不平衡分析结果显示rs2236313、rs9457258、rs720325、rs968334和rs30930255位点间具有中度连锁关系(D'>0.7，r2>0.4)。结论： 本文证实既往报道的SNP是标签SNP，根据基因型填补以后的注释结果认为白癜风6q27区域的关联基因为RNASET2基因。

白癜风； 易感基因； 精细定位

白癜风(Vitiligo)是一种常见的色素脱失性疾病。本病多为后天发生，临床主要表现为受累部位出现境界清晰、大小不等、形态各异的色素脱失斑。除皮肤外，毛发以及黏膜部位均可累及[1]。本病极度影响美观，给患者身心带来严重负担。目前为止，关于白癜风的发病机制有黑素细胞自毁学说、神经学说、自身免疫学说和遗传学说等，但是具体发病原因并不明确。近年来，根据国内外学者的研究，多认为白癜风是一种复杂疾病，遗传和环境因素共同作用导致白癜风的发生和发展[2]。

目前随着大通量基因分型技术、分子生物学技术和生物信息学技术的飞速发展，许多学者对白癜风发病的遗传学因素进行了深入研究[3,4]。2010年，本课题组利用全基因组关联分析的方法在中国汉族人群中发现了一个新的白癜风易感位点，即在染色体6q27存在一个约200 kb的区域与白癜风易感性显著相关[5]。该研究结果得到国内外学者的认可，因此对6q27区域进行精细定位研究，进一步缩小易感区域，对发现白癜风易感基因以及在分子遗传学水平上阐明白癜风的发病机制具有重要意义。本研究在前期研究的基础上，对该区域内利用基因型填补(imputation)的方法和质量控制处理后，筛选出24个标签SNP位点进行进一步基因分型、连锁不平衡分析和条件回归分析，以期对白癜风易感区域进一步定位，为寻找其易感基因奠定基础。

1 材料与方法

1.1 研究对象 本研究收集2942例白癜风样本，其中男1629例和女1313例；平均年龄为(28.38±14.60)岁。所有患者均经伍德灯检测，根据白癜风的诊断标准由至少两位皮肤科副主任医师或以上专家确诊。正常对照样本为2850名(其中男1572名和女1278名；平均年龄为33.97±13.70岁)，均来自皮肤科门诊就诊的非白癜风患者，其一、二、三级亲属也都要求不能患有白癜风，且不能伴有其他自身免疫性疾病或是其他系统性疾病。专门的调查员对患者和对照进行问卷调查，收集相关信息。本研究获得安徽医科大学伦理委员会批准并符合赫尔辛基宣言原则。在患者和对照人员知情同意的情况下采集外周静脉血3～4 mL，放置于5 mL的EDTANa2抗凝管中，-80℃冰箱储存。

1.2 研究方法

1.2.1 基因组DNA的提取和标准化 用Flexi Gene DNA提取试剂盒按照产品操作说明书提取样本基因组DNA，经检测其浓度后，标准化至15～20 ng/μL，并放置于-20℃冰箱保存备用。

1.2.2 SNP位点筛选 根据前期GWAS研究结果，做基因型推算(imputation)处理，结果得到98975个SNPs；其次进行质量控制，以infor≥90%为选取条件，剩余15427个SNPs；对于该区域内所有位点利用HaploReg2数据库进行基因和功能注释，再将这些位点在Blood eQTL数据库中进行相关基因注释，期望发现功能性变异位点，结合P<10-5，最终挑选了24个SNP位点进一步研究。

1.2.3 基因分型 采用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA，Sequenom Massarray iPLEX系统(Sequenom, San Diego, CA)对筛选出的SNP位点进行基因型分型。

1.3 统计学方法 利用PLINK 1.07和SPSS 16.0软件进行Hardy-Weinberg(HWE)平衡、最小等位基因频率(MAF)、优势比(Odds ratio，OR)、95%可信区间(Confidence intervals，CI)和P值分析，各组间比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基因分型 24个SNPs点中，rs76862907、rs77577614、rs78870722、rs75278634分型不符合Hardy-Weinberg 平衡(P-hwe<0.05)且P>0.05，故未做进一步分析，剩余20个SNPs均符合Hardy-Weinberg 平衡(P-hwe>0.05)，但SNP rs117222308得率(call rate)为0.042，故也未做进一步分析。SNP点rs2236313、rs9457258、rs720325、rs968334、rs3093025、rs55802221、rs1012656、rs6930998、rs1331299的等位基因频率在病例组和对照组之间存在统计学差异，见表1。

表1 24个SNPs位点等位基因频率的病例与对照比较

2.2 条件回归分析结果 条件回归分析结果(见表2)：控制SNP rs2236313后，只有rs720325、rs968334、rs9457258和rs3093025的P<0.05。但是分别控制rs720325、rs968334、rs9457258和rs3093025后，rs2236313的均P>0.05，故提示没有独立信号存在。

2.3 连锁不平衡分析结果 在HapMap(CHB+JPT)数据库中查询5个阳性SNPs的r-square值。数据结果提示5个SNPs(rs2236313、rs9457258、rs720325、rs968334、rs3093025)间有中度连锁关系，所有的D＇>0.7，r2> 0.4(图1)。

图1 5个阳性SNPs的LD Block示意图

3 讨论

白癜风是一种常见的皮肤色素脱失性疾病，多由后天获得而来，其发病无明显性别差异。白癜风的发病并不明确，但是其分子发病机制的研究是目前研究热点。国内外学者利用全基因组关联分析(GWAS)的方法对白癜风的易感基因进行了研究。本课题组前期利用GWAS的方法将白癜风易感基因定位在6q27区域的一个约200 kb的范围内[3]， 但是并没有发现白癜风的真正易感基因。为了进一步在中国汉族人群内将白癜风的易感位点6q27区域进行精细定位，本课题组通过基因型填补、连锁不平衡分析和条件回归分析等方法在2942例的白癜风患者和2850名健康对照者进行了深入研究。结果发现，在24个标签SNPs点中，9个 SNPs位点的等位基因频率在病例组和对照组具有统计学意义，但条件回归分析并未发现新的独立信号存在。连锁不平衡分析发现rs2236313、rs9457258、rs720325、rs968334和rs3093025这5个阳性SNPs具有中度连锁关系。本研究证实前期GWAS研究中发现的6q27区域内的rs2236313位点是中国汉族人群白癜风的常见变异的标签SNP，结合Blood eQTL数据库分析提示与6q27区域的关联基因为RNA SET2基因。

RNA SET2基因系II类肿瘤抑制基因，其编码分泌型糖蛋白RNA SET2，隶属于核糖核酸酶Rh/T2/S家族，具有催化活性功能[4]。研究发现，RNA SET2参与肿瘤的形成，比如卵巢癌、黑素瘤，而且发现RNA SET2的表达量降低[5，6]。另外，也有研究发现RNA SET2能够增强细胞氧化应激反应的敏感性，加速细胞凋亡[7]，从而可能参与白癜风的发病，因为氧化应激反应是白癜风的发病机制之一。

2010年，有学者在6q27区域内也发现了17个白癜风易感的SNPs位点，包括位于CCR6基因上游的rs6902119位点[8]。由于本课题组前期GWAS芯片数据不完全覆盖欧洲人所报道的位点，故本研究通过基因型填补的方法发现了该位点与中国汉族人白癜风无明显相关性，这说明本研究发现的标签SNP与欧洲人群相比具有较大的遗传异质性，这也为今后不同种族的白癜风发病风险预测、基因诊断以及药物开发奠定了一定的基础。

2013年有研究提示SNP rs2301436与小柳原田病(Vogt-Koyanagi-Harada，VKH)具有相关性，而白癜风也是VKH的一个临床特征[9]。本研究通过条件回归分析发现rs2301436与本研究所报道SNP rs2236313来自同一关联信号，这强烈提示6q27区域内也可能存在与白癜风、VKH以及自身免疫均相关的易感基因。

在白癜风的发病中，遗传及免疫机制在其发病中发挥重要作用[10]，其中，国内学者有研究发现中国寻常型白癜风与HLA-DRB1*070X、HLA-DRB1*1201和HLA-DQB1*0201具有明显相关性[11，12]。本研究是在前期GWAS研究的基础上对6q27区域进行精细定位研究，该区域与HLA所在的6q21区域尚有一定距离。虽然本研究没有发现新的独立信号存在，但是通过基因型填补及统计学分析再次证实了6q27区域内的rs2236313位点是中国汉族人群白癜风的常见变异的标签SNP，根据基因型注释以后的结果提示在中国汉族人群白癜风患者中与6q27区域的关联基因为RNA SET2基因。接下来将会进一步对该基因进行变异的检测和功能学研究，以期发现真正的易感基因，为进一步从分子遗传学水平详细阐明白癜风的发病机制，同时在为进行基因诊断、遗传咨询以及风险预测方面打下了坚实的基础。

[1] Taieb A, Picardo M. Clinical practice. Vitiligo[J]. N Engl J Med,2009,360(2):160-169.

[2] 张学军.皮肤性病学[M].8版.北京：人民卫生出版社，2013.185-187.

[3] Birlea SA, Gowan K, Fain PR, et al. Genome-Wide association study of generalized vitiligo in an isolated european founder population identifies SMOC2, in close proximity to IDDM8[J]. J Invest Dermatol,2009,130(3): 798-803.

[4] Campomenosi P, Salis S, Lindqvist C, et al. Characterization of RNA SET2, the first human member of the Rh/T2/S family of glycoproteins[J]. Arch Biochem Biophys,2006,449(1-2):17-26.

[5] Acquati F, Morelli C, Cinquetti R, et al. Cloning and characterization of a senescence inducing and class II tumor suppressor gene in ovarian carcinoma at chromosome region 6q27[J]. Oncogene,2001,20(8):980-988.

[6] Monti L, Rodolfo M, Lo Russo G, et al. RNA SET2 as a tumor antagonizing gene in a melanoma cancer model[J]. Oncol Res,2008,17(2):69-74.

[7] Thompson DM, Parker R. The RNA se Rny1p cleaves tRNAs and promotes cell death during oxidative stress in Saccharomyces cerevisiae[J]. J Cell Biol,2009,185(1):43-50.

[8] Jin Y, Birlea SA, Fain PR, et al. Variant of TYR and autoimmunity susceptibility loci in generalized vitiligo[J]. N Engl J Med,2010,362(18):1686-1697.

[9] Yi X, Du L, Hou S, et al. FGFR1OP tagSNP but not CCR6 polymorphisms are associated with Vogt-Koyanagi-Harada syndrome in Chinese Han[J]. PloS One,2013,8(7):e69358.

[10] 杨珂,张学军.白癜风免疫发病机制研究进展[J].中国麻风皮肤病杂志,2012,28(3):188-191.

[11] 王珺,孙晓杰,赵玉铭,等.白癜风125例临床分析及与HLA-DQR1相关性研究[J].中国麻风皮肤病杂志,2009,25(12):888-889.

[12] 瞿镔,徐爱娥,赵玉铭,等.白癜风243例临床分析及与HLA-DQB1相关性研究[J].中华皮肤科杂志,2003,36(12):693-695.

(收稿：2016-12-27 修回：2017-02-17)

The fine mapping study for vitiligo susceptibility gene of 6q27 region in Chinese Han population

GAOMin,LIZenggang,ZHENGXiaodong,ZHOUFusheng,TANGXianfa.

DepartmentofDermatology,FirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230022,China

Correspondingauthor:GAOMin,E-mail:ahhngm@163.com

Objective:To perform the fine mapping study for vitiligo susceptibility region 6q27 in order to identify the susceptibility gene in Chinese Han population. Methods: Total 24 tag SNPs were genotyped in 2942 patients with vitiligo and 2850 healthy controls. The PLINK 1.07 and SPSS19.0 software were used for statistical analysis, linkage disequilibrium and regression analysis. Results: (1) There were significant differences in the allele frequencies of rs2236313, rs9457258, rs720325, rs968334, rs3093025, rs55802221, rs1012656, rs6930998 and rs1331299 between the cases and controls. The regression analysis revealed that there was no independent signals in these SNPs. (2) The linkage disequilibrium analysis showed there was moderate linkage among rs2236313, rs9457258, rs720325, rs968334 and rs3093025 (D'>0.7，r2>0.4). Conclusion: This study identified the previous report, in which SNP rs2236313 is the tag SNP in the vitiligo patients of Chinese Han and the RNASET2 gene is an associated gene in 6q27 region.

vitiligo; susceptibility gene; fine mapping

国家自然科学基金资助(编号：81072460)

安徽医科大学第一附属医院皮肤科，安徽合肥，230022

高敏，E-mail:ahhngm@163.com