RP—HPLC法测定肝康宁片中虎杖苷的含量

张国跃?刘春河

[摘要] 目的 建立RP-HPLC法测定肝康宁片中虎杖苷含量的方法。 方法 采用Kromasil C18色谱柱（5?m，4.6mm×250mm）；甲醇-0.005mol/L乙酸铵溶液（28∶72）为流动相，流速1.0mL/min；柱温35℃，检测波长306nm。 结果 虎杖苷进样量在0.02824～0.4236μg之間，与峰面积呈良好的线性关系，r=0.9999，加样回收率平均为97.51%，RSD=1.83%。 结论 本法结果简便可行、准确度高，适用于当肝康宁片中虎杖苷的含量测定。

[关键词] RP-HPLC法；肝康宁片；虎杖苷；虎杖

[中图分类号] R286 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2017）09-39-03

Content of polydatin in liver corelle tablet determined by RP-HPLC

ZHANG Guoyue1 LIU Chunhe2

1.Shanxi Institute for Food and Drug Control， Xi'an 710065， China； 2.Tianyou Hospital Affiliated to Wuhan University of Science & Technology， Wuhan 430064， China

[Abstract] Objective To establishi the method to determine the content of Polydatin in Liver Corelle tablet by RP-HPLC. Methods Kromasil C18 chromatographic column （5?m， 4.6mm×250mm） was used. Methanol-0.005mol/L and ammonium acetate solution （28∶72） was the mobile phase， and the current speed was 1.0Ml/min.The column temperature was 35℃. Detection wavelength was 306nm. Results Sample size of Polydatin was within 0.02824μg-0.4236μg， which showed good linear relationship with peak area， r=0.9999. Average recovery rate was 97.51%， RSD=1.83%. Conclusion This method is simple， feasible and accurate. It is suitable for the determination of polydatin in Corelle tablets.

[Key words] RP-HPLC method； Liver corelle tablet； Polydatin； Polygonum cuspidatum

肝康宁片是由白花蛇舌草、虎杖、垂盆草、柴胡、 人参、白术、等十二味药味制成的薄膜衣片，具有清热解毒，活血疏肝，健脾祛湿的功效，常用于急慢性肝炎，湿热疫毒蕴结、肝郁脾虚证候的辅助治疗。原质量标准收载于国家食品药品监督管理局标准[WS-10127（ZD-0127）-2012-2012Z]中，含量测定项仅测定虎杖中的蒽醌类成分大黄素，没有二苯乙烯类的含量测定，不能有效的控制该制剂中虎杖所含有的二苯乙烯类成分含量，而二苯乙烯类的药理活性与该药物的治疗目的密切相关，此类成分的抗炎等作用对于该药物的治疗效果起着相当大的作用[1-2]，故测定该药物中二苯乙烯类的代表成分虎杖苷显得尤为重要，原标准亟待完善。受陕西步长高新制药有限公司的委托，按照国家药典委员会关于药品质量标准技术要求，研究建立了用RP-HPLC法测定肝康宁片中虎杖苷含量的方法，并进行了方法学验证。该方法操作简便、快捷，准确度高、重复性好，可很好地监控该产品中虎杖苷的含量。

1 仪器与试药

1.1 仪器

安捷伦高效液相色谱仪、Waters Waters 2695/ 2487/ 2669高效液相色谱仪（紫外和二极管阵列检测器），Waters Empower工作站；月旭 C18色谱柱（5?m，4.6mm×250mm）；赛多利斯AGME235S电子分析天平；KQ-500DE型数控超声波清洗器。

1.2 其他

虎杖苷对照品（批号：111575-200502）由中国食品药品检定研究院提供。试剂均为分析纯，水（超纯水），甲醇（色谱纯）。“肝康宁片”、不含虎杖的阴性样品均由委托方制备。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Kromasil C18色谱柱（5?m，4.6mm×250mm）；甲醇-0.005mol/L乙酸铵溶液（28∶72）为流动相，流速1.0mL/min；柱温35℃，测定波长306nm。

2.2 对照品溶液的制备

取虎杖苷对照品7.51mg，加稀乙醇溶解并定容至100mL量瓶中，再用稀乙醇稀释成每1mL含15.02μg的溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备

取肝康宁片，研细，精密称取约0.5g，置具塞锥形瓶中，精密加稀乙醇25mL，称定重量，85℃水浴回流45min，冷却，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，微孔滤膜（0.45μm）滤过，取续滤液，即得。

2.4 专属性试验

取不含虎杖的阴性样品，按上述2.3供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液，将对照品溶液、阴性对照溶液和供试品溶液各10μL，分别注入高效液相色谱仪中，测定，结果未见对虎杖苷测定的干扰。见图1。

2.5 线性关系考察

将虎杖苷对照品溶液（浓度0.1412mg/mL）适量，稀释成浓度为2.824、5.648、14.12、28.24和56.48μg/mL的溶液，照文中的色谱条件测定，进样量均为10μL，虎杖苷质量（X）作为横坐标，虎杖苷峰面积（Y）作为纵坐标，线性回归结果表明，进样量在0.02824～0.5648μg范围内，与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为 Y=40119X+710.41（r=0.9999），见图2。

2.6 仪器精密度考察

取虎杖苷对照品溶液，重复进样7次，峰面积的RSD=0.28%，表明精密度良好。

2.7 精密度

2.7.1 样品重复性考察 取6份同一样品，照上文中的方法制备试样，测定，结果虎杖苷平均含量为1.97mg/g，RSD=1.39%。见表1。

2.7.2 中间精密度考察 取同一批样品，由本实验室的其他实验员按照上文中的试验方法，在不同时间使用另一台高效液相色谱仪测定样品中的虎杖苷含量，与与本文作者测定结果进行比较，RSD=2.02%。

2.8 供试液稳定性考察

取同一份样品，照文中的方法制备试样，分别在0、1、4、7、14、19、28h测定，结果RSD=1.65%，表明供试液在28h内较稳定。

2.9 准确度考察

精密称取样品约0.25g共6份，精密加入浓度为0.531mg/mL虎杖苷对照品溶液1mL，挥干溶剂，照上文中的方法制成供试液，测定，结果平均回收率为97.51%，RDS=1.83%。见表2。

2.10 峰纯度检测

取样品溶液和对照品溶液，分别进样10μL，用二极管阵列检测器，在200～500nm波长范围扫描PDA光谱，结果，样品PDA光谱与对照品PDA光谱一致，同时考察样品峰纯度，结果供试品溶液色谱峰纯度符合要求。

3 讨论

虎杖为蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.的干燥根茎和根，主要成分有蒽醌类、二苯乙烯类、酚类和黄酮类等，具有祛风利湿、祛痰止咳、清热解毒、活血化瘀等功效，近年来虎杖的研究较多，药理学研究显示，虎杖具有保护心血管系统、肝保护、抗菌抗病毒、抗炎镇痛、抗肿瘤、提高免

疫力等多种药理活性[2-7]，其中的二苯乙烯类和蒽醌类成分如虎杖苷、大黄素等是其主要活性成分，现行的《中国药典》（2015年版一部）含量测定标的物就是虎杖苷和大黄素 [8]，虎杖苷可在生物体内脱去糖苷转化为白藜芦醇，而白藜芦醇是近年来植物抗毒素研究的热点，安梅等[9]从白藜芦醇的来源、一般特性、生物合成、体内代谢和药理活性等方面综述了白藜芦醇抗肿瘤作用及机制的研究进展和抗氧化、抗炎等效应的研究近况，认为白藜芦醇作为多种中药治疗炎症、脂类代谢和心脏疾病等的有效成分，其作用于心血管系统疾病、抗肿瘤和抗炎作用等的临床研究和基础研究也在不断深入，白藜芦醇的药理学作用正日益得到重视，有望成为防治相关疾病的新型药物，其临床应用前景将更加广阔。

截止目前，尚未有测定肝康宁片中虎杖苷含量的报道，根据肝康宁片的处方和制备工艺，结合相关文献[10-14]，分别以80%的甲醇、甲醇及乙醇、稀乙醇作为提取溶剂，分别加热回流45min，结果以稀乙醇为溶剂制备的供试品溶液虎杖苷的含量最高；再以稀乙醇为提取溶剂，分别用30、60、90min的处理时间和超声处理、加热回流处理方式来制备供试品溶液，结果文中的制备方法较好，延长处理时间，虎杖苷的含量没有明显增加。曾试验过乙腈-水、乙腈-水-0.2%磷酸溶液等流动相系统， 结果与本文中流动相条件下差异不大，从经济和安全角度考虑，确定了本文中的流动相。还通过改变流速、柱温和改用其他品牌色谱柱分别运行供试品溶液，结果样品色谱峰的峰型、面积等无明显变化。鉴于虎杖苷的光稳定性不太好，整个试验过程应注意避光操作[15]。

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（收稿日期：2017-03-16）