凉山地区猪腹泻样本中PEDV、PDCoV和GARV感染检测

彭艳伶，李昊，余琼，李建，张斌，沈思思，任玉鹏*

（1.四川省西昌市农牧局，四川 西昌 615000；2.西昌学院动物科学院，四川 西昌 615013；3.西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041）

凉山地区猪腹泻样本中PEDV、PDCoV和GARV感染检测

彭艳伶1，李昊2，余琼1，李建1，张斌3，沈思思3，任玉鹏3*

（1.四川省西昌市农牧局，四川 西昌 615000；2.西昌学院动物科学院，四川 西昌 615013；3.西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041）

为了解四川省凉山州部分猪场3种猪腹泻病毒的感染情况，本研究采用RT-PCR方法，分别对来自德昌、冕宁县和宁南县多个规模化猪场的60份猪腹泻样本进行病原检测，包括猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪Delta冠状病毒（PDCoV）和猪A群轮状病毒（GARV）。结果显示:3种病原的检出率分别为PEDV 15%、PDCoV 33.33%、GARV 58.33%，其中冕宁县PDCoV检出率为65%，而GARV检出率更高达70%；3种病毒混合感染的情况普遍存在，总体混合感染率分别为:德昌15%（3/20），冕宁60%（12/20），宁南5%（1/20），混合感染类型中尤以PDCoV和GARV的混合感染率最高，提示PDCoV和GARV可能存在更高的协同致病性。

猪流行性腹泻病毒；猪Delta冠状病毒；猪A群轮状病毒；RT-PCR

猪腹泻病是生猪养殖过程中常见的疾病之一，在所有引起腹泻的病毒性因素中，猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪A群轮状病毒（GARV）是目前临床上较为常见的两种病原[1]。近年还出现诸多新发病原从猪腹泻病料中检出，如猪Delta冠状病毒（PDCoV）就是一个导致猪腹泻的冠状病毒科新成员，主要引起仔猪腹泻、脱水等[2]。

四川省凉山州当前猪腹泻疫情较严重，但近年关于病原感染情况尚未见报道，这一定程度上制约了疫病防控措施的制定。故本研究采用RT-PCR方法对2016年8～9月份采自凉山州德昌、冕宁、宁南县三个地方的60份猪腹泻样本进行病原学检测，以期为本地区腹泻病的防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

1.1.1 试剂 Taq聚合酶、DNA Marker II均购自生工生物工程（上海）股份有限公司；DH5α感受态细胞、pMD19-T Simple Vector、PrimeScriptTMRT-PCR Lit（RNA反转录试剂盒）均购自宝生物工程（大连）有限公司；质粒抽提试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒购自北京天根生化科技有限公司。

1.1.2 仪器 PCR 仪（Veriti 96 Well Thermal Cycle，ABI公司），凝胶成像仪（Universal Hood II，BIO-RAD公司），电泳仪（DYY-5型，北京六一仪器厂）。

1.2 引物 本试验中用于RT-PCR法检测 PEDV、PDCoV和GARV的引物均参照文献[1，3]合成，所有引物均由宝生物工程（大连）有限公司合成。具体参数见表1。

表1 PEDV、TGEV、PDCoV、GARV 扩增引物

1.3 样本采集与处理 本试验待检样本于2016年8～9月采自四川省凉山州，其中德昌县3个规模化养殖场20份、冕宁县2个规模化猪场20份、宁南县2个规模化猪场20份，共计60份腹泻样本。所有样本均来源于30～60日龄保育猪。将样本与无菌0.1mol/L PBS缓冲液按 1∶4（m/v）比例稀释，振荡混匀，静置5min，以10000r/min离心10min，取上清液待检。

1.4 cDNA模板制备 参照宝生物公司RNAiso Plus（总RNA提取试剂）说明书，提取样本总RNA。依次加入上述上清液200μL、RNAiso Plus 500μL、氯仿150μL，振荡混匀后离心取上清；然后加入等体积异丙醇，离心弃上清；再加入 75%乙醇1 mL（经DEPC处理），离心弃上清；样品自然干燥后加入45μL无RNA酶去离子水，溶解沉淀，置-40℃保存。

根据反转录试剂盒说明书进行反转录。反应体系：样本总 RNA 4μL，5×Buffer 4μL，Random primer 1 μL，PrimeScript RTase 1 μL，dH2O 10 μL，总体系20μL。反转录程序：37℃ 15min，85℃ 15s，16℃ 1min。反转录产物置-40℃保存。

1.5 目的基因的PCR扩增 分别用检测PEDV、PDCoV和GARV的3对引物，对待检样本中的cDNA模板进行PCR扩增。反应体系为：2×PCR Master Mix 12.5μL，上、下游引物各 1.0 μL，cDNA 2.0 μL，dH2O 8.5μL，总体积 25μL。PCR 扩增条件为：95℃预变性5 min，95℃ 30 s，55℃ 30 s，72 ℃ 55 s，35 个循环，72℃ 10min。取上述扩增产物各5μL在琼脂糖凝胶板上以100V恒压电泳45min，通过凝胶成像系统观察记录结果。对目的基因进行回收、连接和转化，使其克隆至pMD19-T载体，并送样到上海英骏生物技术有限公司测序，用Blast比对分析结果。对不同来源样本中的3种病毒病原的检出率进行统计分析。

图1 3种病原的RT-PCR扩增结果

2 结果

2.1 RT-PCR扩增产物电泳及测序 将待检样本cDNA的PCR扩增产物克隆至pMD19-T载体，并送样到上海英骏生物技术有限公司测序，经Blast比对分析，结果表明：与NCBI上已登录的序列相比，PEDV扩增片段同源性为99%，PDCoV扩增片段同源性为95%，GARV扩增片段同源性为92%。

2.2 不同猪群的感染情况 在凉山州德昌、冕宁及宁南3个地区中，猪群中PEDV、PDCoV和GARV检出率均为100%（3/3），3种病原总体检出率分别为：PEDV 15%，PDCoV 33.33%，GARV 58.33%，表明这3种病毒在本地区广泛存在。PDCoV和GARV的总体检出率均显著高于PEDV，表明此二种病原是引起本次腹泻疫情的主要病原（见表2）。

表2 3种病原的检出率

3个地区不同病原的感染情况也有所差异（图2）。来源于德昌县和宁南县5个猪场的腹泻样本中，3种病原感染情况相似，PEDV检出率均为10%，PDCoV为15%，GARV为20%。冕宁县2个猪场的腹泻样本中，PDCoV检出率显著高于其他两个地区，其检出率为65%。此外，GARV在所有猪场中的检出率均为3种病原中的最高，表明引起近期凉山地区猪只腹泻的主要病原为GARV，同时新发病原PDCoV也广泛存在于该地区各养殖场中。

图2 不同地区3种病原感染情况

2.3 病原的混合感染情况 在所检测的腹泻样本中，存在多种病原混合感染的情况（表3）。3个地区猪场总体混合感染率分别为：德昌15%（3/20），冕宁60%（12/20），宁南 5%（1/20）。其中冕宁县部分样本存在3种病原同时检出的情况（混感率为10%），表明引起冕宁县养殖场腹泻的病毒性病因更为复杂多样。此外，3种病原两两混合或3种病原同时检出的情况均存在，但检测数据表明，3个地区不同来源的样本中，PDCoV和GARV混合感染率分别为德昌县10%（2/20），冕宁县 55%（11/20），宁南县 5%（1/20），均显著高于同群其他感染类型。该结果一定程度上反映出PDCoV和GARV可能存在更高的协同致病性。

表3 3种病原的混合感染率

3 结论与分析

本试验对采自四川德昌、冕宁县及宁南县的腹泻样本进行了PEDV、PDCoV和GARV检测，结果3种病毒的总体检出率分别为：PEDV 15%，PDCoV 33.33%，GARV 58.33%，提示这3种病毒在本地区均有感染。此外，不同猪场主导的病因不同，因此养殖场应根据自身实际情况制定具有针对性的疫病防控措施。GARV在3个地区的检出率均显著高于PDCoV和PEDV（P＜0.01），说明当前引起凉山州部分猪场腹泻疫情的主要病原为GARV。近年来国内大部分研究表明，在规模化养殖场腹泻病因中PEDV所占比例最高。如：霍金耀等[4]对2011～2012年华中地区190份腹泻样本进行检测，发现PEDV阳性率高达62.11%，TGEV和 GARV阳性率分别为 0.53%和7.37%；常铁城等[5]对2014年来自全国11个省市42个猪场的165份样本进行检测，发现PEDV群体阳性率为85.71%，单独感染PEDV的猪场占总数的59.52%。但本次研究却表明，当前凉山州规模化养殖场中GARV感染情况比较严重，个别地方检出率高达70%。因此应进一步对GARV在本地区的流行规律进行系统调查，同时建立长期有效的监控机制，加强针对该病原的疫苗免疫，避免引起更大规模的腹泻疫情。

作为猪腹泻的新病原，PDCoV也逐渐受到关注。此前本实验室已对2013年采自四川及重庆的222份临床样本进行了检测，结果发现PDCoV阳性检出率为7%[3]，表明这种新发病原已在本地区流行。本次来自凉山州的60份腹泻样本中，PDCoV总体检出率为33.33%，冕宁县的检出率更高达65%。说明PDCoV也是引起该地区部分猪场腹泻的重要病原。

本次调查还发现，腹泻样本中PEDV、PDCoV和GARV 3种病原存在两两混合感染或3种病原同时感染的情况，而这可能是导致部分猪只病情加剧，迅速死亡的主要原因。检测结果显示：来源于3个不同地方的样本中，PDCoV和GARV的混合感染率最高，提示PDCoV和GARV可能存在更高的协同致病性，同时也表明当前本地区腹泻病因复杂多样，应进一步加强上述两种病原的实验室检测，做到早诊断、早治疗。

[1]曹恭貌，张斌，岳华，等.四川部分猪场PEDV、TGEV、GARV和PLV感染状况调查[J].动物医学进展，2016，37（1）：118-122.

[2] Lee S，Lee C.Complete genome characterization of Lorean porcine deltacoronavirus strain LOR/LNU14-04/2014[J].Genome Announc，2014，2（6）：1114-1191.

[3]任玉鹏，张斌，汤承，等.同时检测PEDV和TGEV及PDCoV的多重RT-PCR方法的建立及初步应用[J].中国兽医科学，2016，46（6）：756-762.

[4]霍金耀，郑逢梅，陈陆，等.猪流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒、A群轮状病毒和嵴病毒多重RT-PCR检测方法的建立及临床应用[J].中国兽医学报，2013，33（12）：1792-1794.

[5]常铁成，陈建飞，冯力，等.2014年部分地区猪流行性腹泻病毒流行病学调查[J].中国预防兽医学报，2016，38（4）：335-338.

Infection Dete Ction of PEDV，PDCoV and GARV in Pig Farms of Liangshan Prefecture

Peng Yanlin1，Li Hao2，Zhang Bin3，et al.
（1.Agriculture and Animal Husbandry Bureau of Xichang City，Sichuan Xichang 615000；2.Animal Science College of Xichang University，Sichuan Xichang 615013；3.College of Life Science and Technology，Southwest University for Nationalities，Sichuan Chengdu 610041，China）

To investigate the infection of PEDV，PDCoV and GARV from different pig farms in 3 counties of Liangshan prefecture，this study detected three kinds of pathogens from a total of 60 feces samples by RT-PCR method.The results showed that the detection rates of these three kinds of pathogens were PEDV 15%，PDCoV 33.33%，GARV 58.33%，respectively.It indicated that PEDV，PDCoV and GARV were widespread in pig farms of Liangshan prefecture.Besides，the positive rate of PDCoV in Mianning county was 65%，which was significantly higher（P＜0.01）than that of the others，and the detection rate of GARV in this area was 70%.Moreover，These three pathogens often presented mixed infection，and the mixed infection rates in different areas were Dechang 15%（3/20），Mianning 60%（12/20），Ningnan 5%（1/20），respectively.Within these mixed infection types，the mixed infection rate of PDCoV and GARVwas highest，it could be inferred that GARV and PDCoV might have synergistic pathogenicity.

PEDV；PDCoV；GARV；RT-PCR

S854.43

B

1001-8964（2017）07-0018-04

2017-02-23

“十三五”国家重点研发计划（2016YFD0500705）

彭艳伶（1968-），女，兽医师，现从事动物防疫工作。

*通讯作者：任玉鹏(1986-)，男，实验师，研究方向:动物传染病病原学。