护肝解纤汤对肝纤维化相关因子的影响

白珊珊，王彦双，张晓燕，何雅军

1．广州市海珠区疾病预防控制中心，广州510288; 2．海南医学院第二附属医院检验科，海口570100; 3．暨南大学医学院附属广州市红十字会医院，广州510220

护肝解纤汤对肝纤维化相关因子的影响

白珊珊1，王彦双2，张晓燕3，何雅军3

1．广州市海珠区疾病预防控制中心，广州510288; 2．海南医学院第二附属医院检验科，海口570100; 3．暨南大学医学院附属广州市红十字会医院，广州510220

目的观察护肝解纤汤对肝纤维化过程中相关细胞因子结缔组织生长因子(CTGF)、转化生长因子(TGF-β1)、血小板衍生生长因子(PDGF)的影响及其可能机制。方法以四氯化碳腹腔注射8周建立大鼠肝纤维化模型。实验分对照组、模型组、小柴胡汤组和护肝解纤汤组。护肝解纤汤组于大鼠肝纤维化模型鼠第9周起分别予高、中、低剂量护肝解纤汤(处方中姜黄分别为低剂量组6 g，中剂量组9 g，高剂量组15 g，其他成分一致)。免疫组化染色观察肝组织细胞因子CTGF、TGF-β1、PDGF在各组中表达。结果与模型组比较，高、中剂量护肝解纤汤组肝组织CTGF、PDGF表达显著减少(P＜0．05);TGF-β1表达只有高剂量护肝解纤汤组显著降低(P＜0．05)。结论护肝解纤汤组相关促纤维化细胞因子CTGF、TGF-β1、PDGF表达减少，可能是其影响肝纤维化的重要机制。

护肝解纤汤;肝纤维化;细胞因子;大鼠

纤维化由纤维增生和降解不平衡所导致，表现为脏器组织细胞外基质(ECM)的过度增生和沉积。但临床上，将肝脏组织对机体内外因素引起的炎性损伤和肝细胞坏死所进行的修复称为肝纤维化。肝纤维化的发生与机体多种细胞因子密切相关，如结缔组织生长因子(CTGF)、转化生长因子(TGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)等。有报告显示，肝纤维化是一种可逆过程，是肝硬化和肝癌发生的基础阶段，临床中及时控制肝纤维化发展、恶化，对减少肝癌和肝硬化的发病起到重要作用［1-3］。本研究以姜黄为主，加入柴胡、黄芩、炙甘草、法半夏等组成复方中药制剂“护肝解纤汤”，探讨对肝纤维化上述相关细胞因子的影响。

1 材料与方法

1．1 实验动物

雄性SD大鼠，体质量150～200 g，SPF级，于SPF动物实验室中饲养，自由进食、饮水，饲以条杆状饲料。

1．2 材料

CTGF和TGF-β1一抗来自Proteintech公司，PDGF一抗来自联科生物技术有限公司。抗鼠/兔HRP标记聚合物和显色液DAB均来自Proteintech公司。

1．3 实验方法

1．3．1 建立大鼠四氯化碳肝纤维化模型

在实验大鼠腹腔内注射0．025 mL四氯化碳(用花生油1∶6稀释)，每周腹腔注射3次，持续12周。

1．3．2 实验分组及给药

实验用SD大鼠65只，随机分为6组。A组(对照组，10只):常规饲养，8周后处死5只，剩余5只不予处理，继续饲养4周。B组(模型组，15只):予以单纯造模处理，12周后处死，留取标本待检。C、D、E组(低、中、高剂量护肝解纤汤组，每组各10只):腹腔注射四氯化碳8周，第9周起分别予护肝解纤汤1号、2号、3号方灌胃，每天1次，共4周。F组(小柴胡汤阳性对照组，10只):腹腔注射四氯化碳8周，第9周起给予小柴胡汤灌胃。护肝解纤汤由柴胡9 g，黄芩9 g，炙甘草6 g，法半夏9 g，加入姜黄熬制而成;其中，姜黄在低剂量组为6 g(1号方)，中剂量组9 g(2号方)，高剂量组15 g(3号方)。在上述中药中加水700 mL，充分搅拌，浸泡大约30 min后用武火煎煮至沸腾，再用文火煎煮大约30 min后去渣取汁成200 mL汤剂即可。灌胃剂量均为每100 g实验大鼠灌胃给药1 mL。12周后处死大鼠，取肝脏组织，并用10%甲醛固定。

1．3．3 免疫组化染色

CTGF、TGF-β1、PDGF的免疫组化均为免疫酶法。石蜡包埋，将肝脏组织蜡块切片、脱蜡，蒸馏水洗2次，于pH值6．0柠檬酸缓冲液中微波煮沸修复30 min，常温冷却，PBS洗3 min×3次，5%小牛血清封闭20～40 min，PBS洗3 min×3次，加特异性一抗4℃过夜，PBS洗3 min×3次，加二抗15～20 min，PBS洗3 min×3次，DAB显色1～2 min，自来水冲片刻终止反应，苏木精复染1～2 min，蓝化，自来水冲20 min，常规梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，镜下观察棕褐色为阳性。每组各选5张切片进行图像分析并照相。

结果判定:光学显微镜高倍镜(×400)下随机选取3个视野观察每张切片，以棕色或棕黄色区域判定为阳性表达区，通过Image-Pro Plus 6．0计算每张图片平均光密度(平均光密度=光密度IOD/所选面积)。

1．3．4 统计学分析

2 结果

正常对照组CTGF、TGF、PDGF仅有轻微表达;模型组CTGF、TGF、PDGF明显高表达;小柴胡汤组CTGF、TGF、PDGF表达下降;与模型组比较，高、中剂量护肝解纤汤组肝组织CTGF、PDGF表达显著减少(P＜0．05);高剂量护肝解纤汤组TGF-β1表达降低(P＜0．05)。见表1，图1。

3 讨论

肝纤维化发病和多种细胞因子密切相关。细胞因子的释放激活肝星状细胞(HSC)，活化的HSC通过自分泌和旁分泌释放多种细胞因子并继续活化HSC，合成分泌大量ECM，细胞因子－细胞－ECM相互作用，最终在肝脏组织中形成大量的纤维组织沉积。细胞因子TGF-β1是肝组织中最强的致纤维化因子，对ECM起到双重调节的作用，既抑制其降解，又促进其合成;同时参与HSC的激活过程［4］。唐静等［5］研究显示，ERK通路可能参与HSC中TGF-β1通道Smad基因表达和蛋白磷酸化的过程，TGF-β1介导的ERK通路与肝纤维化关系密切。CTGF是一种新型细胞因子，在正常肝组织有少量表达，在纤维化肝组织中表达增高。研究表明，CTGF在细胞增殖和分化中发挥重要作用，亦导致ECM分泌增多，而HSCs是CTGF的重要来源［6］。PDGF是重要的促有丝分裂因子，在细胞分裂和增殖中发挥重要促进作用，参与HSC活化、增殖和迁移，刺激HSC活化并产生Ⅰ型、Ⅲ型胶原，并通过增强TMP－1表达抑制胶原酶活性，从而降低ECM降解［7］。由于PDGF是已知最强的促HSCs增殖、分化细胞因子，处于静息状态的HSCs几乎不表达PDGF和PDGF受体(PDGFR)，当肝组织受损时，活化的HSCs可促使PDGF进一步分泌，PDGFR分泌增强是HSC激活早期的重要表现形式。因此，阻断PDGF信号通路对HSCs增殖和胶原产生起重要抑制作用，并能加快其凋亡［8］。可见，在抗肝纤维化研究中，针对各种细胞因子的防治方法引起学者的极大兴趣［9］。

表1 肝组织CTGF、TGF、PDGF表达Tab．1 The expression of CTGF，TGF-β1，and PDGF in hepatic tissues(μm－2)

图2 免疫组化染色(×400)Fig．2 Immunohistochem ical staining(×400)

在抗肝纤维化研究中，祖国医药因其多层次、多靶点、多途径作用机制和毒副作用较小的优越性而发挥着越来越大的作用。对小柴胡汤研究表明，其药理作用广泛，主要包括保肝利胆、抗炎、抗病毒、抗菌、调节中枢神经、调控机体免疫功能等［10］，其中柴胡舒肝解郁、调理气机，对纤维增生起重要抑制作用，甘草补中益气、解毒和胃，其有效成分甘草甜素能使纤维增生速度减慢、γ－球蛋白减少，对肝细胞再生有促进作用，从而有效降低肝硬化发生率，明显减轻肝脏间质的炎症反应;甘草与柴胡配伍能加强舒肝解郁、解毒和胃作用，有效减少肝损伤和肝硬化发生;黄芩有效成分黄芩色素能降低α－Ⅰ型、Ⅲ型前胶原mRNA水平，产生抗细胞增殖和抗纤维化作用，黄芩苷可通过线粒体途径，加强白血病T细胞系凋亡，对癌细胞生长起到明显的抑制作用。本研究以姜黄为主，加入柴胡、黄芩、炙甘草、法半夏等组成复方中药制剂“护肝解纤汤”，探讨护肝解纤汤防治肝纤维化的作用与相关细胞因子的关系。

本实验以模型对照组为参照判断模型组造模是否成功，小柴胡为治疗阳性对照，判断低、中、高剂量护肝解纤汤对肝纤维化的细胞因子CTGF、TGF-β1、PDGF的影响变化。结果表明，经不同浓度护肝解纤汤治疗后，CTGF、TGF-β1、PDGF表达明显下降，并呈现一定的剂量相关性。提示抑制此三种细胞因子表达水平，可能是护肝解纤汤治疗肝纤维化的作用机制之一。

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［3］郑艳丽．IGF-1在大鼠肝纤维化过程中的动态变化及扶正化瘀方对肝纤维化的影响［D］．石家庄:河北医科大学，2011，9-21．

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［6］Shen H，Fan J，Minuk G，et al．Apoptotic and survival signals in hepatic stellate cells［J］．JCent South Univ(Med Sci)，2007，32 (5):726-734．

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［8］舒建昌，王红利，叶国荣，等．姜黄素治疗肝纤维化及相关细胞因子变化的研究［J］．中药材，2007，30(11):1421-1425．

［9］舒建昌，吴海恩，皮新军，等．姜黄素抑制肝纤维化大鼠脂质过氧化物的生成及肝脏TGF-β1和PDGF的表达［J］．中国病理生理杂志，2007，23(12):2405-2409．

［10］党双锁，李亚萍．TGF-β1在肝纤维化研究中的进展［J］．世界华人消化杂志，2010，18(16):1631-1636．

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The effect of huganjiexian decoction on related factors in liver fibrosis

BAIShanshan1，WANG Yanshuang2，ZHANG Xiaoyan3，HE Yajun3
1．Haizhu District Center for Disease Prevention and Control，Guangzhou 510288，China; 2．Laboratory Department，The Second Affiliated Hospital of Hainan Medical University，Haikou 570100，China; 3．The Fourth Affiliated Hospital of Jinan University，Guangzhou Red Cross Hospital，Guangzhou 510220，China

ObjectiveTo observe the effect and possiblemechanism of Huganjiexian Decoction on liver fibrosisrelated cytokines CTGF，TGF-β1，and PDGF．MethodsLiver fibrosisr at models wereestablished by intraperitoneal injection of carbon tetrachloride for eightweeks．The ratswere divided into controlgroup，modelgroup，Minor Bupleurum Decoction group，and Huganjiexian Decoction group(adm inistered with high，middle，and low doses of turmeric containing 15，9 and 6 g respectively，from week 9-12)．Immunohistochemical staining was used to detect the expression of CTGF，TGF-β1，and PDGF in liver tissues．ResultsThe expression levels of CTGF and PDGF in liver tissues in the high and middle dose groups significantly decreased compared to themodel group(P＜0．05)，while the expression level of TGF-β1 decreased significantly only in the high dose group(P＜0．05)．ConclusionHuganjiexian Decoction could downregulate the expressions of fibrosis-promoting cytokines CTGF，TGF-β1，and PDGF，which might be one of the importantmechanism protective effects of against liver fibrosis．

Huganjiexian Decoction;Hepatic fibrosis;Cytokine;Rats

R575

A

2095-378X(2017)02-0087-04

10．3969/j．issn．2095-378X．2017．02．005

2017－04－19)

白珊珊(1988—)，女，硕士研究生，检验技师，从事临床检验诊断学

何雅军，电子信箱:heyajun0801@163．com