介孔二氧化硅复合微球的制备及药物控释应用

郑林萍，许光宇,石莹莹，宋仕永，张普玉

(1.河南大学 a.药学院;b.民生学院;c.化学化工学院，河南 开封 475004;2.开封市卫生学校，河南 开封 475002)

介孔二氧化硅复合微球的制备及药物控释应用

郑林萍1a，许光宇2,石莹莹1b，宋仕永1a，张普玉1c

(1.河南大学 a.药学院;b.民生学院;c.化学化工学院，河南 开封 475004;2.开封市卫生学校，河南 开封 475002)

采用溶胶-凝胶法，以三乙醇胺为碱性沉淀剂，十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)为模板剂，正硅酸乙酯(TEOS)为硅源，制备了介孔结构介孔二氧化硅纳米粒子(MSNs)。以硅烷偶联剂3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(MPS)对介孔二氧化硅进行表面修饰，以甲基丙烯酸(MAA)为原料，采用原位聚合法制备了具有pH响应性的介孔二氧化硅纳米粒子@聚甲基丙烯酸(MSNs@PMAA)复合微球。利用小角X射线粉末衍射仪、扫描电子显微镜和透射电子显微镜等仪器对其结构和形貌进行了表征。研究结果表明：MSNs@PMAA复合微球平均直径为167 nm，具有长程有序介孔孔道，MSNs的比表面积、孔容和孔径分别从1 081 m2/g、1.756 cm3/g 和 3.2 nm 减小至506 m2/g、1.340 cm3/g和1.7 nm。以多柔比星(DOX)为模型药物，MSNs@PMAA复合微球显示了较高的载药率和包封率，在体外有明显的pH响应性。

介孔二氧化硅纳米粒子；溶胶-凝胶法；环境响应性；药物控释

0 引言

介孔二氧化硅纳米粒子(mesoporous silica nanoparticles，MSNs)具有规则的多孔结构，孔道分布均匀且相互独立，比表面积(>900 m2/g)和孔容(>0.9 cm3/g)高，热稳定性好，孔径大小可在几纳米到十几纳米内进行调控[1]，因此，其在吸附分离[2-4]、催化反应[5-6]、色谱[7]和生物医学[8-12]等领域有广阔的应用前景。

环境响应性系统的物理或化学性质会随着环境(如温度、pH值和光等)的改变而发生相应的变化[13]，所以在药物输送中具有很好的应用价值。由于肿瘤细胞组织的pH值比正常细胞略低，呈弱酸性，使得pH响应性复合纳米载体广泛应用于药物载体研究中[14]。文献[15]将多柔比星(doxorubicin，DOX)通过腙键负载到MSNs表面用于肝癌的治疗，腙键在酸性的环境中发生断裂，从而使药物释放出来。文献[16]采用ZnO量子点作为介孔二氧化硅孔道的堵封分子，制备了pH响应性的给药系统，在酸性条件下，ZnO量子点可被降解，从而使药物从孔道中大量释放出来。文献[17]将聚L-谷氨酸(poly-L-glutamic acid,PLGA)修饰到介孔二氧化硅上，制备了pH敏感性的介孔二氧化硅粒子，该产物在水溶液中具有较好的分散性，并且载药率高，客体分子DOX从MSNs-PLGA中的释放具有pH响应性，且累积释放率较高。

DOX是一种临床常用的蒽环类抗生素，可抑制癌细胞DNA的合成，然而由于其心脏毒性、骨髓抑制及消化道不良反应等副作用限制了临床应用[18]。本研究以聚甲基丙烯酸(PMAA)为原料，采用沉淀聚合法制备了具有pH响应性的介孔二氧化硅纳米粒子复合微球。并以抗肿瘤药物DOX为模型药物，考察该复合微球的负载及体外释放行为。

1 试验

1.1 试剂与仪器

正硅酸乙酯(TEOS)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(MPS)和N，N-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)，均购自Aladdin公司；三乙醇胺(TEA)，天津科密欧化学试剂有限公司；过硫酸钾(KPS)，天津市大茂化学试剂厂；注射用盐酸多柔比星(DOX·HCl)，深圳万乐药业有限公司。试剂均为分析纯。

Bruker D8 Advance型X射线粉末衍射仪(德国Bruker公司)；JOEL 6700E型扫描电镜(日本JEOL公司)；JEM-2010型透射电镜(日本JEOL公司)；Nano ZS型激光粒度仪(英国Malvern公司)；AVATAR-360FTIR型光谱仪(美国Nicolet公司)；ASAP 2020M+C型氮气物理吸附仪(美国Micromeritics公司)；Nano ZS型SDTA851e型热重分析仪(瑞士Mettler Toledo公司)。

1.2 介孔二氧化硅纳米粒子@聚甲基丙烯酸(MSNs@PMAA)的制备

称取模板剂CTAB约0.50 g，加入70 mL去离子水，60 ℃下搅拌溶解，依次加入15 mL乙二醇和 4 mL TEA，混合均匀后缓慢加入TEOS 2.5 mL，溶液由澄清变成乳白色。60 ℃下继续反应2 h后，将产物离心，用去离子水和乙醇洗涤至中性，得到正硅酸乙酯-介孔二氧化硅纳米粒子(CTAB-MSNs)。

将上述产物转移到酸性乙醇溶液(9 mL浓盐酸加入100 mL乙醇)中，80 ℃下加热回流24 h以去除模板剂，离心纯化，用去离子水洗涤至中性，60 ℃真空干燥，即得介孔二氧化硅纳米粒子(MSNs)。取0.3 g MSNs分散到20 mL甲苯中，加入200 μL MPS，120 ℃下回流反应6 h，离心分离，并用乙醇洗涤数次以去除未反应的MPS，60 ℃真空干燥过夜，产物标记为3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷-介孔二氧化硅纳米粒子(MPS-MSNs)。

在带有冷凝管的三颈烧瓶中，将0.30 g MPS-MSNs溶于60 mL去离子水中，超声分散。溶解后加入0.70 g 甲基丙烯酸(MAA)。将混合物加热至70 ℃，氮气保护下，搅拌1 h后，分别加入0.13 g MBA和 0.06 g KPS，在氮气保护下继续反应6 h。将所制备的产物用乙醇和水反复洗涤以去除未反应的单体和杂质，最后将产物在50 ℃真空中干燥，得介孔二氧化硅纳米粒子@聚甲基丙烯酸(MSNs@PMAA)。

1.3 DOX的负载与体外释放

本试验采用常用的抗肿瘤药物DOX作为客体分子，研究复合微球的体外释放行为。分别称取10 mg MSNs和10 mg MSNs@PMAA复合微球,分散于质量浓度为1 g/L的DOX水溶液中，室温下避光摇床振荡24 h后，取出离心并用去离子水洗涤几次，合并上清液，用紫外分光光度计在480 nm处测定DOX吸光度。对照标准曲线，计算出其载药率和包封率。载药率和包封率计算公式为：

分别称取10 mg负载DOX的MSNs和10 mg MSNs@PMAA复合微球,溶于5 mL去离子水中，超声1 min使之在水中分散，然后将其转移到透析袋中(截留分子量8 000～14 000 )。将其分别放到200 mL(pH值分别为5.5、6.8、7.4)的缓冲溶液中，避光环境下，37 ℃摇床振荡，每隔一定时间取出5 mL的溶液测定，并及时补充介质。通过测定DOX的紫外吸光度，计算出不同时间的释药率。释药率计算公式为：

2 结果与讨论

2.1 测试与表征

图1为MSNs和MSNs@PMAA复合微球的小角X射线粉末衍射图。从图1中曲线a 可以看出：在2θ=2.14°处显示一个很强的衍射峰，相应的衍射晶面指数为100；另外2个弱的衍射峰分别位于2θ=3.17°和2θ=4.24°，对应的衍射晶面指数分别为110和200，这属于典型的有序六方孔道结构[11]。图1中曲线b在2θ=2.14°处仍有1个衍射峰，但衍射强度有很大程度的降低。这是由于纯PMMA是无规聚合物，没有衍射峰，MSNs@PMAA在2.14°处仍有峰，说明MSNs孔道负载聚合物后仍然保持二维六方相结构，衍射强度有很大程度的降低，说明MSNs@PMAA复合微球孔道的规整性有所降低。

图1 MSNs和MSNs@PMAA复合微球的小角X射线粉末衍射图

图2为MSNs和MSNs@PMAA复合微球的扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)图和透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)图。从图2a和2b可以看出：MSNs粒径分布均匀，粒子呈球形，直径在 60 nm左右，且孔道排列较为规整。由图2c和2d可以看出：MSNs被包覆后直径比原来稍增大，直径约为85 nm。

图3为MSNs和MSNs@PMAA复合微球的的氮气吸附-脱附曲线和相应的孔径分布曲线。根据国际纯粹与应用化学联合会(international union of pure and applied chemistry,IUPAC)的分类，样品的吸附-脱附曲线为典型的IV型等温曲线，具有HI型滞后环，表明其具有介孔结构[19]。

图2 MSNs和MSNs@PMAA复合微球的SEM图和TEM图

图3 MSNs和MSNs@PMAA复合微球的氮气吸附-脱附等温线和吸附孔径分布图

通过BJH孔径分布测试计算氮气吸附-脱附等温线，可得出：MSNs的比表面积、孔容和孔径分别为1 081 m2/g、1.756 cm3/g和3.2 nm。在包覆聚合物之后，比表面积、孔容和孔径分别减小到506 m2/g、1.340 cm3/g和1.7 nm，可为药物分子提供载入空间。

图4 CTAB-MSNs、MSNs、MPS-MSNs和MSNs@PMAA复合微球的红外光谱图

图5为MSNs和MSNs@PMAA复合微球的热失重曲线。MSNs包覆聚合物后，聚合物在加热到一定温度时会分解损失质量，而MSNs的质量保持不变。所以通过热重分析可以计算出聚合物的质量。图5中显示MSNs的质量损失率为13.3%，而MSNs@PMAA复合微球的质量损失率为25.4%，这样，通过计算得到MSNs@PMAA复合微球中聚合物壳层的质量分数为12.1%，这个结果与TEM观察到的核壳结构相符合。

图6为MSNs和MSNs@PMAA复合微球的直径分布图，为动态光散射测量结果。由图6a可知：MSNs平均直径为120 nm，多分散指数PDI=0.22，说明颗粒直径分布较窄。MSNs@PMAA复合微球的平均直径为167 nm，PDI=0.21，相比MSNs，其平均流体力学直径增大了47 nm。通过比较图6和图2可发现：TEM图显示的直径小于动态光散射测量的结果，这是因为TEM图是处于高真空干态下测得的，而动态光散射测定是在溶液中，其粒子表面存在水化层，故动态光散射所测的值比TEM偏大。

图5 MSNs和MSNs@PMAA复合微球的热失重曲线图6 MSNs和MSNs@PMAA复合微球的直径分布图

2.2 载药和体外药物释放

在pH=8.0时，把DOX载入MSNs@PMAA复合微球里面，根据DOX紫外吸收标准曲线测得DOX在MSNs@PMAA复合微球中的载药率为20.5%，包封率为87.4%。作为对比，将DOX负载到MSNs中，得到DOX在MSNs中的载药率和包封率分别为11.2%和43.8%。试验结果表明：MSNs在包覆聚合物之后，其载药率和包封率都有较大提高。

为了研究其释放性能，分别在pH值为5.5、6.8、7.4条件下，于37 ℃下考察了负载DOX的MSNs@PMAA复合微球对DOX的释放动力学行为，其累积释药曲线如图7a所示。由图7a可知：DOX在12 h内的累积释放率相对较快，随后释放变慢，并随pH值的减小，药物的累积释放率依次增大。在pH值为7.4时，DOX的累积释放率很少，只有35.1%的药物释放出来；在pH值为6.8时，药物的累积释放率有所增加，24 h后为54.6%；当pH值减小至5.5时，药物的累积释放率达66.4%。表明MSNs@PMAA复合微球在体外有明显的pH响应性。作为对比，将DOX负载到纯的MSNs中，MSNs的累积释药曲线见图7b。由图7b可知：不同pH值条件下的药物释放率差别很小。24 h内，pH值在7.4、6.8、5.5 时，DOX的累积释放率分别为16%、22%和29%。与MSNs@PMAA复合微球相比，其释放率明显减少，所以，MSNs@PMAA复合微球比MSNs在体外具有更好的pH响应性。

图7 MSNs@PMAA复合微球和MSNs在不同pH值溶液中的累积释药曲线

3 结论

本文制备了介孔二氧化硅纳米粒子@聚甲基丙烯酸(MSNs@PMAA)复合微球,用DOX作为模型药物研究了其载药和体外释药行为，其载药率可达20.5%，包封率为87.4%。在12 h内，MSNs@PMAA复合微球中DOX的累积释放率相对较快，且随pH值减小而增大，pH 值为7.4、6.8、5.5时，DOX的最大累积释放率分别为35.1%、54.6%和66.4%。MSN@PMAA复合微球在体外有明显的pH响应性，有望成为理想的抗肿瘤药物载体。

[1] TARN D,ASHLEY C E,XUE M,et al.Mesoporous silica nanoparticle nanocarriers:biofunctionality and biocompatibility[J].Accounts of chemical research,2013,46(3):792-801.

[2] PEREZ-QUINTANILLA D,SANCHEZ A,DEL H I,et al.Preparation,characterization,and Zn2+adsorption behavior of chemically modified MCM-41 with 5-mercapto-1-methyltetrazole[J].Journal of colloid and interface science,2007,313(2):551-562.

[3] ZHENG K,YANG H,WANG L,et al.Amino-functionalized mesoporous silica nanoparticles:adsorption and protection for pcDNA3.1(+)-PKB-HA[J].Journal of porous materials,2013,20(5):1003-1008.

[4] LI X,SHI B,WANG Y,et al.Preparation of monodispersed mesoporous silica particles and their applications in adsorption of Au3+and Hg2+after mercapto-functionalized treatment[J].Microporous and mesoporous materials,2015,214:15-22.

[5] GE Y,JIA Z,GAO C,et al.Synthesis of mesoporous silica-alumina materials via urea-templated sol-gel route and their catalytic performance for THF polymerization[J].Russian journal of physical chemistry,2014,88(10):1650-1655.

[6]DICKSCHAT A T,FREDERIK B,MARTIN B,et al.Preparation of bifunctional mesoporous silica nanoparticles by orthogonal click reactions and their application in cooperative catalysis[J].Chemistry,2012,18(52):16689-16697.

[7] KIM D J,CHUNG J S,AHN W S,et al.Morphology control of organic-inorganic hybrid mesoporous silica by microwave heating[J].Chemistry letters,2009,33(4):422-423.

[8] ARGYO C,WEISS V,BRAUCHLE C,et al.Multifunctional mesoporous silica nanoparticles as a universal platform for drug delivery[J].Chemistry of materials,2013,26(11):435-451.

[9] NATARAJAN S K,SELVARAJ S.Mesoporous silica nanoparticles:importance of surface modifications and its role in drug delivery[J].RSC advances,2014,4(28):14328-14334.

[10]YOUNGNAM C,RICHARD B B.The preparation of polypyrrole surfaces in the presence of mesoporous silica nanoparticles and their biomedical applications[J].Nanotechnology,2010,21(20):205102-205110.

[11]BECK J S,VARTULI J C,ROTH W J,et al.A new family of mesoporous molecular sieves prepared with liquid crystal templates[J].Journal of the American chemical society,1992,114:27(27):10834-10843.

[12]DERRICK T,ASHLEY C E,MIN X,et al.Mesoporous silica nanoparticle nanocarriers:biofunctionality and biocompatibility[J].Accounts of chemical research,2013,46(3):792-801.

[13]郑晓明,蒋涛,贺枫,等.PNIPAM-b-聚碳酸酯温敏胶束的制备及用作药物控制释放载体的研究[J].高分子学报,2011(8):895-902.

[14]YOUNSOO B,SHIGETO F,ATSUSHI H,et al.Design of environment-sensitive supramolecular assemblies for intracellular drug delivery:polymeric micelles that are responsive to intracellular pH change[J].Angewandte chemie international edition,2003,42(38):4640-4643.

[15] LEE C H,CHENG S H,HUANG I P,et al.Intracellular pH-responsive mesoporous silica nanoparticles for the controlled release of anticancer chemotherapeutics[J].Angewandte chemie international edition,2010,49(44):8214-8219.

[16] MUHAMMAD F,GUO M,QI W,et al.pH-Triggered controlled drug release from mesoporous silica nanoparticles via intracelluar dissolution of ZnO nanolids[J].Journal of the American chemical society,2011,133(23):8778-8781.

[17] ZHENG J,TIAN X,SUN Y,et al.pH-sensitive poly(glutamic acid) grafted mesoporous silica nanoparticles for drug delivery[J].International journal of pharmaceutics,2013,450(1/2):296-303.

[18] ZHUANG Y,LIU X.Anthracycline cardiotoxicity and its preventive measures[J].Anti-tumor pharmacy,2011,1(4):322-327.

[19] 近藤精一,石川达雄,安部郁夫.吸附科学[M].李国希,译.北京:化学工业出版社,2005:40-50.

[20] TIAN B S,YANG C.Temperature-responsive nanocomposites based on mesoporous SBA-15 silica and PNIPAAm:synthesis and characterization[J].Journal of physical chemistry c,2009,113(12):4925-4931.

国家自然科学基金项目(51375142)；河南省科技厅科技攻关基金项目(142102210393);河南大学大学生创新创业支持计划基金项目(MSCXCY2015054)

郑林萍(1965-),女,河南开封人,教授,硕士,硕士生导师,主要从事药用高分子材料方面的研究.

2016-07-18

1672-6871(2017)02-0099-06

10.15926/j.cnki.issn1672-6871.2017.02.019

R944

A