DNA条形码在新型毒品原植物恰特草种属鉴定中的应用研究

2017-08-01申钰柯刘陈业陈鹏升陈云霞

森林公安 2017年3期

申钰柯刘陈业周旦陈鹏升陈云霞

申钰柯刘陈业周旦陈鹏升陈云霞

毒品原植物是指用来提炼、加工成鸦片、海洛因、甲基苯丙胺、吗啡等麻醉药物和精神药物的原植物。其中罂粟、古柯、大麻被称为世界三大毒品原植物。恰特草作为一种新型毒品原植物近两年被大量走私入境。

恰特草（Catha edulis），又名：巧茶、也门茶、阿拉伯茶、埃塞俄比亚茶等，属卫矛科（Celastraceae）巧茶属（Catha）植物，产于东非和阿拉伯半岛等地区。其含兴奋化学物质卡西酮，对人体中枢神经具有刺激作用，长期嚼食会染癖成瘾，又被称为“东非罂粟”，具有严重的社会危害性。世界卫生组织将恰特草归类为Ⅱ类软性毒品。很多国家已将其列为兴奋剂或受管制药物，严禁旅客携带或邮寄入境。

2014年，恰特草已列入《精神药品品种目录（2013版）》，被视为第一类精神药品，在我国毒品打击范围之内，凡种植、持有、贩卖、走私、服食恰特草均属违法犯罪行为。

恰特草作为一种新型的毒品原植物，其经烘炒后的枝叶，外形酷似茶叶，形态上具有很高的伪装性。一些不法分子在高额利润的驱使下铤而走险进行非法走私与贸易。而目前，恰特草的鉴定依然是依靠传统的形态识别，但是对于一些形态特征被破坏，外观不完整的检材并不适用，具有一定的局限性，同时对案件的办理也造成了一定阻碍。除此之外，传统的形态识别法主要依靠鉴定人的经验，对鉴定人的专业知识要求较高，在无法使用传统的形态特征鉴定时，就需要依靠一些不依赖于形态特征的新技术、新方法进行识别鉴定。

近年来，DNA分子技术被广泛应用到植物样本的检验，使一些微量植物物证也能进行种类鉴定或是个体识别。并且，多种手段联合应用于植物物证的检验将成为一种新的发展趋势。国内对于毒品原植物的分子鉴定技术已经有一定的研究，但对于新型毒品恰特草的分子鉴定技术研究还是空白。本研究致力于对恰特草的DNA分子鉴定技术进行探索，以期建立从DNA提取、条形码片段扩增到数据分析的恰特草分子鉴定体系，同时初步建立恰特草的DNA条形码数据库，实现恰特草的快速准确鉴定，为此类毒品案件的打击提供技术支持。

一、材料与方法

（一）材料

恰特草新鲜植株由广州海关缉私局提供（图1-A），-20℃保存于国家林业局森林公安司法鉴定中心分子实验室；经烘炒处理过的茶叶状恰特草叶片由南京海关缉私局提供（图1-B），常温保存于国家林业局森林公安司法鉴定中心植物实验室。

图1 供试材料

（二）方法

1.总DNA的提取

分别取新鲜及烘炒处理的恰特草叶、茎各50mg，液氮速冻，用冷冻研磨仪研磨1min，分别用国产DNA提取试剂盒（TIANGEN公司）及进口的DNeasy Plant Mini Kit植物基因组DNA提取试剂盒（QIAGEN公司）提取恰特草基因组DNA。DNA的质量采用1%琼脂糖凝胶电泳法检测。

2.PCR扩增及测序

以恰特草DNA为模板，分别用引物rbcL- F（5'- ATGTCACCACAAACAGAAAC-3'）、rbcL-R（5'-TCGCATGTACCTGCAGTAGC-3'），trnL-F-F（5'-TTTGAACTGGTGACACGAG-3'）、trnLF-R（5'-GGTTCAAGTCCCTCTATCCC-3'），扩增叶绿体rbcL及trnL-F基因序列。

PCR反应在Biometra公司PCR仪上进行。反应体系为：2.5μL buffer，2μL dNTPs，2μL MgCl2，0.5μL primer-F，0.5 μL primer-R，2 μL DNA，0.2μL Ex-Taq，15.3μL MiliQ H2O。反应程序为：首先94℃预变性5min，然后每个循环94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，进行38个循环，最后72℃延伸10min。

PCR反应结束后，扩增产物送华大基因进行测序，测序引物即为扩增引物。为保证所测序列的准确性，对rbcL及trnLF序列进行双向测序。

3.序列分析

对测定的核苷酸序列进行序列分析。序列的拼接校准使用DNASTAR软件进行；序列相似性用NCBI的BLAST程序（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）进行分析。

二、结果与分析

（一）提取效果检测与分析

通过琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，1-3号均在2000bp以上出现完整的条带（图2-A），表明在新鲜的恰特草组织中提取到了基因组DNA，但1号与3号样均有一定的拖带，说明DNA有一定降解，质量不高；2号样的质量相对较好。4号未出现相应的条带，并未提取到基因组DNA（见图3），说明经烘炒处理过的恰特草叶片中DNA可能已严重降解。通过进一步的PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳验证，1-3号DNA都可用来开展下一步实验（图2-B）。

（二）rbcL及trnL-F序列片段的获得及分析

以恰特草基因组DNA为模板，利用rbcL引物进行PCR扩增，从中获得725bp rbcL片段序列（基因登录号：KX377452）；利用trnL-F引物进行PCR扩增，从中获得453bp trnL-F片段序列（基因登录号：KX377451）。将其在 NCBI上进行BLAST相似性检索，均与卫矛科植物具有一定相似性。但也通过检索与研究发现，GenBank中恰特草的DNA条形码数据仍是空白。

三、讨论

（一）恰特草DNA提取方法

新鲜的恰特草植株由于其叶和茎的细胞、形成层细胞分裂旺盛，代谢过程活跃，物质合成迅速，因此新鲜的恰特草植株的细胞中DNA含量很高，这个比较有利于DNA的提取。本研究用国产DNA试剂盒（TIANGEN公司）成功地从新鲜的恰特草植株的茎细胞中抽提出了恰特草DNA。

但目前各地公安机关和各海关部门送检的恰特草多为经处理烘炒过的检材。经多次重复实验，发现国产DNA提取试剂盒（TIANGEN公司）无法从处理过的恰特草中提取到可用以进一步PCR扩增的基因组DNA。主要原因有：①经烘炒处理过的恰特草由于受到高温处理致使DNA发生降解。②国产DNA试剂盒（TIANGEN公司）提取DNA精度较差，尤其对于一些微量DNA的提取效果不佳。

本研究通过使用进口DNeasy Plant Mini Kit植物基因组DNA提取试剂盒（QIAGEN公司）成功地从经烘炒处理过的恰特草样本的茎中提取出了较高质量的DNA。这表明进口DNA试剂盒提取DNA精度较高，适用于物证鉴定中提取经烘炒处理过的恰特草样本DNA。

（二）经烘炒处理过的恰特草不同部位DNA降解程度不同

通过使用DNeasy Plant Mini Kit植物基因组DNA提取试剂盒（QIAGEN公司）提取经烘炒处理过的恰特草样本的茎和叶片组织发现，从茎的组织中能成功提取较高质量的基因组DNA，并且能够用于进一步的PCR扩增，而叶片组织无法提取到可用于扩增的DNA。这说明在经烘炒处理过后，恰特草的叶片和茎中的基因组DNA发生了不同程度的降解[10]，但是茎中的DNA降解程度要明显低于叶片的降解程度。将此研究结论应用于鉴定过程中，在鉴定经烘炒处理过的恰特草检材时，应尽量选取茎部位的恰特草检材，由于茎中的DNA降解程度相对叶片较低，这样更有利于提取恰特草DNA。但由于实验材料的限制，该实验仅针对一批烘炒处理的恰特草样本进行了DNA提取实验，或许不同批次材料处理程度不一样，其中的DNA降解程度就不同，所以结论还需进一步论证确实。该部分研究结论仅供参考。

图2 DNA检测

（三）初步建立恰特草DNA条形码数据库

GenBank是美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）建立的DNA序列数据库。GenBank也是目前全球公用的最具权威性、使用最频繁的DNA序列数据库。将研究获得的恰特草核苷酸序列在GenBank中进行检索比对，只与卫矛科的其他植物具有一定相似性，并未有相似程度高的物种。说明研究获得的序列无误，并非其他科属植物，但也说明一点，目前GenBank中仍缺少恰特草DNA条形码rbcL与trnL-F序列片段。将获得的恰特草核苷酸序列上传到GenBank中，获取恰特草rbcL的基因登录号（KX377452）与trnL-F的基因登录号（KX377451）。

近年来，国家林业局森林公安司法鉴定中心也建立了毒品原植物的DNA条形码数据库。通过本研究获得的恰特草DNA条形码序列，也丰富与充实了国家林业局森林公安司法鉴定中心毒品原植物的DNA条形码数据库。对于打击近年来走私恰特草案件是具有现实意义，也拓宽了毒品原植物分子鉴定领域的研究。

（四）DNA条形码鉴定技术在恰特草实际鉴定中的应用

2016年5月，也门籍犯罪嫌疑人玛某乘坐某航班，从广州白云机场口岸入境。经查验，在其行李箱内查获用绿色塑料袋包裹的植物枝叶碎片，净重78312.4g。广州海关缉私局为了查明这起“行李箱藏匿疑似恰特草”案，委托国家林业局森林公安司法鉴定中心对涉案的植物进行种属鉴定。但是该涉案植物检材均为植物枝叶碎片，已无法使用形态特征进行识别鉴定。针对该检材，使用该论文改良的基因组DNA提取法均成功提取到DNA，并通过与该研究建立的DNA条形码序列数据库进行序列比对，送检的3份涉案检材（图3）均为恰特草所有，成功进行了种属鉴定。