二仙汤对去卵巢骨质疏松大鼠股骨蛋白质组的影响

刘志文+刘波+吴琪+陈银芳+徐彭+谢慧慧+王莹+杨硕

[摘要] 该实验为探究二仙汤防治骨质疏松的作用及对去卵巢骨质疏松模型大鼠股骨蛋白质组的影响。将雌性SD大鼠按体重随机分为4组，即假手术组、模型组、阿仑膦酸钠组（阿仑膦酸钠，1 mg·kg^-1）、二仙汤组（生药量8 g·kg^-1），其中假手术组和模型组灌服生理盐水，阿仑膦酸钠组按1 mg·kg^-1剂量灌服阿仑膦酸钠，二仙汤组按生药量8 g·kg^-1灌服二仙汤，每日1次，连续给药90 d后检测股骨骨密度，同时应用Nano-LC-LTQ-Orbitrap系统检测股骨骨蛋白，Protein Discovery软件进行蛋白质鉴定，SIEVE软件对蛋白进行相对定量分析。实验结果显示，二仙汤能显著提高去卵巢大鼠股骨骨密度。二仙汤组与模型组相比较共发现41个与假手术组趋势一致的差异蛋白，主要包括生物氧化相关蛋白、信号转导通路相关蛋白、脂肪酸代谢相关蛋白、细胞骨架相关蛋白、能量代谢相关蛋白、糖代谢相关蛋白等。二仙汤能防治骨质疏松症，碳酸酐酶2、整合素β1等相关差异蛋白质可能是其作用靶点。

[关键词] 二仙汤；去卵巢骨质疏松；骨密度；蛋白质组学

[Abstract] This experiment was mainly aimed to investigate the effect of Er-xian decoction on osteoporosis and the femur proteomics in ovariectomized rats with osteoporosis. The female SD rats were randomly divided into sham operation group， model group， Alendronate group （1 mg·kg^-1）， Er-xian decoction group （in dose of 8 g·kg^-1） according to their weight. The rats in sham operation group and model group were gavaged with normal saline；the rats in Alendronate group were gavaged with the Alendronate at the dose of 1 mg·kg^-1 and the rats in Er-xian decoction group were gavaged with Er-xian decoction at the dose of 8 g·kg^-1 ， once a day for continuous 90 days. Then the femoral bone mineral density （BMD） was detected. The femoral bone proteins were detected by NanoLC-LTQ-Orbitrap system， identified by Protein Discovery software， and the intensity of differentially expressed proteins were quantitated by SIEVE software. The results showed that Er-xian decoction could significantly improve femoral BMD in ovariectomized rats. As compared with model group， 41 differentially expressed proteins whose variation trend was consistent with the sham operation group， were found in Er-xian decoction group， mainly including biological oxidation related protein， signal transduction pathway related protein， proteins involved in aliphatic acid metabolism， cytoskeleton related protein， proteins involved in energy metabolism， and proteins involved in glucose metabolism etc. The osteoporosis could be prevented and cured by Er-xian decoction. The differentially expressed proteins such as carbonic anhydrase 2 and integrin β1 may be the action targets for Er-xian decoction.

[Key words] Er-xian decoction；ovariectomized osteoporosis；bone mineral density；proteomics

骨質疏松症（osteoporosis）是绝经后妇女的一种常见病、多发病，临床主要是以骨量减少、骨的微结构破坏为特征，骨骼脆性增加，易发生骨折的一种全身性骨骼疾病[1]。近年来，中医药在骨质疏松治疗中发挥重要作用。二仙汤是上海中医药大学已故名医张伯讷教授针对围绝经期综合征研制的名方，由淫羊藿、仙茅、巴戟天、当归、知母、黄柏6味中药组成[2-3]。作者前期研究已发现二仙汤能显著提高去卵巢大鼠骨密度，有效防治骨质疏松[4]，但分子作用机制并不清楚。

蛋白质组学技术能针对靶组织分析蛋白质的变化，是寻找人类疾病的新生物标志物和发现药物治疗新靶点的一种工具[5]。骨组织是骨质疏松症、骨肿瘤、骨关节炎等疾病的主要发病部位，疾病发生往往伴随蛋白质的变化。本研究采用蛋白质组学技术，在骨组织中寻找二仙汤干预去卵巢骨质疏松大鼠的差异蛋白，挖掘二仙汤防治骨质疏松症的分子机制。

1 材料

1.1 动物

SPF级8月龄雌性SD大鼠，24只，体重300～400 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号SCXK（湘）2013-0004。

1.2 药物

二仙汤方中含有仙茅、淫羊藿、巴戟天、当归、黄柏、知母6味药，均购自江西樟树天齐堂中药饮片有限公司，由本院中药资源组付小梅副教授鉴定为朝鲜淫羊藿Epimedium koreanum Nakai.，仙茅Curculigo orchioides Gaertn.，巴戟天Morinda officinalis HOW，当归Angelica sinensis （Oliv.） Diels，知母Anemarrhena asphodeloides Bge.，黄柏Phellodendron chinensis Schneid.。阿仑膦酸钠（批号E1217060）购于阿拉丁试剂有限公司。

1.3 试剂

RIPA高效裂解液（批号RA223336A），苯甲基磺酰氟（PMSF）（批号RE2173411），BCA蛋白定量试剂盒（批号RD231234），二硫苏糖醇（批号RD232079），碘代乙酰胺（批號SLBP7486V）等均购自Thermo scientific公司；测序级胰酶（批号0000117588）购自Promega公司；乙酸（批号SHBG4397V），丙酮（批号SHBF3379V），碳酸氢铵粉末（批号BCBN6056V）等均购自Sigma-aldrich公司。

1.4 仪器

双能X线吸收骨密度仪（DXA，Lunar公司，美国）；ORBITRAP ELITE质谱仪（Thermo公司，美国）：EASY-nLC 1000 液相仪（Thermo公司，美国）；台式高速冷冻离心机（Sigma公司，德国）；ELX800吸收光酶标仪（美国BioTek仪器有限公司）；分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；C₁₈旋转柱（Thermo Pierce公司，美国）；离心浓缩仪（LABCONCO公司，美国）；EASY-Spray Column（Thermo公司，美国）；Acclaim PepMap100（Thermo公司，美国）。

1.5 二仙汤的制备

计算给药量之后按照2∶2∶2∶2∶1∶1的比例分别取仙茅、淫羊藿、当归、巴戟天、黄柏、知母，加入双蒸水至液面高出药材表面2 cm，先浸泡30 min，武火煎煮40 min，后文火煎煮30 min，反复煎煮2次，最后将2次药液合并，将提取液浓缩至生药质量浓度0.8 g·mL^-1。

2 方法

2.1 动物造模、分组及给药

将动物随机分为4组，其中18只去卵巢[6]的雌性大鼠随机分为3组：模型组、阿仑膦酸钠组、二仙汤组，每组6只，以仅作手术切开而未作卵巢切除的6只雌性大鼠为假手术组，假手术组与模型组均灌服生理盐水，阿仑膦酸钠组按1 mg·kg^-1剂量灌服阳性对照药物阿仑膦酸钠，二仙汤组按生药量8 g·kg^-1灌服二仙汤，给药容积均为0.01 mL·g^-1，所有动物连续给药90 d。

2.2 骨密度检测

采用双能X线吸收骨密度仪对大鼠左股骨骨密度检测。

2.3 蛋白组学

2.3.1 蛋白样品前处理 骨组织全蛋白提取：随机挑选每组各3只大鼠右侧股骨样本，剪下骨骺端用锡箔纸包裹后捣碎，精密称取0.15 g，置于预先冷冻干燥的洁净研钵中，将组织粗略研磨后快速加入液氮研磨组织成粉末状，转移至1.5 mL EP管中，加入1 mL配置好的裂解液（RIPA裂解液-PMSF100∶1），置于摇床上4 ℃摇40 min，将其4 ℃，14 000×g离心40 min，弃去细胞沉淀上清液即为骨组织蛋白，以BCA试剂盒测定各样品蛋白浓度，放-80 ℃保存备用。

蛋白质的酶解：将蛋白样品在4 ℃融化，取20 μL样品，加入适量DTT溶液，37 ℃水浴60 min，加入适量IAA溶液，避光反应45 min，加入5倍量-20 ℃预冷的冰丙酮，-20 ℃沉淀过夜。样品4 ℃，14 000×g离心5 min，弃去上清液，并加入丙酮1.0 mL，涡旋混匀后，4 ℃，14 000×g离心5 min，弃去上清液，重复3次，以清洗蛋白。将蛋白重悬于100 mmol·L^-1碳酸氢铵溶液600 μL中，按照酶-蛋白1∶50加入测序胰酶，37 ℃恒温水浴酶解过夜。加入适量8%乙酸，使pH小于6以终止酶解反应。

多肽的除盐及冻干：将酶解完的样品按照Pierce C₁₈Spin Columns说明书中的步骤进行脱盐处理，最后将多肽洗脱液用离心浓缩仪进行冷冻干燥，-20 ℃保存备用。

2.3.2 样品检测 用0.1%甲酸溶液80 μL溶解样品，Nano-LC-LTQ-Orbirap联用系统对蛋白样品进行检测。

色谱条件：分析柱为EASY-Spray C₁₈色谱柱（75 μm×15 cm，3 μm），预柱为Acclaim PepMap100（C₁₈，75 μm×2 cm，3 μm）。流动相A为0.1%甲酸水，流动相B为0.1%甲酸乙腈。进样量4 μL，流速250 nL·min^-1，柱温30 ℃。蛋白样品流动相浓度梯度见表1。

LTQ Orbitrap Elite质谱条件：正离子模式，喷雾电压1.7 kV，毛细管温度250 ℃。一级图谱开启FTMS扫描模式，二级图谱35%的碰撞能量，采用Ion trap扫描模式，扫描范围300～1 800。

2.4 数据分析

骨密度检测数据均以±s表示，采用SPSS 11.5统计分析软件t检验进行分析比较，P<0.05有统计学意义，P<0.01有显著差异。LC-MS所收集到的RAW文件则导入Protein Discovery软件进行蛋白质鉴定，运用SIEVE软件对不同组别骨蛋白进行相对定量定性分析。

3 结果

3.1 二仙汤提高大鼠股骨骨密度

与假手术组相比，模型组大鼠股骨密度明显下降，二仙汤则能提高股骨骨密度，见表2，显示二仙汤具有防治骨质疏松的作用。

3.2 LC-MS总离子流图

各组样品总离子流图谱（TIC），见图1。与假手术组相比较，模型组大鼠样本的TIC图从外观上有一定差异。而与模型组相比较，二仙汤组大鼠样本的TIC图也有一定差异。

3.3 股骨差异蛋白质的分析

假手术组、模型组、阿仑膦酸钠组、二仙汤组股骨共检测到1 685个蛋白。以模型组（M）为对照，假手术组（J）、阿仑膦酸钠组（Y）及二仙汤组（D）与模型组差异蛋白，见表3。

4 讨论

本研究采用经典的去卵巢方法复制绝经后骨质疏松症大鼠模型，3个月后发现骨密度明显变化，与假手术组相比，模型组股骨密度平均值显著降低，提示去卵巢骨质疏松大鼠造模成功。同时以二仙汤干预后，股骨密度明显高于模型组，表明二仙汤能提高去卵巢大鼠骨密度，对大鼠切除卵巢引起的骨质疏松症有防治作用，与前期研究结果一致[4]。

蛋白质组学是研究生物学过程和描绘细胞和组织变化的有效手段。在医药学领域，蛋白质组学也是阐释人类疾病病因，发病机制和探索药物作用新靶点的重要工具。本研究中以蛋白质组学技术为研究手段，从股骨组织的蛋白差异表达来分析与二仙汤提高骨密度相关的蛋白质，以说明二仙汤防治骨质疏松症的分子机制。差异蛋白生物学功能探讨如下。

4.1 生物氧化相关蛋白

氧化应激与骨质疏松症密切相关，妇女绝经后雌激素水平显著降低，活性氧（ROS）水平升高诱发骨质疏松症，补肾壮骨中药抗骨质疏松主要是通过对雌激素水平、钙磷代谢与氧化应激的调节来实现的[7-8]。通过搜索Uniprot数据库Molecular Function发现，碳酸酐酶2具有促进破骨细胞分化，调控骨吸收作用，碳酸酐酶3主要参与氧化应激反应。碳酸酐酶2能够促进CO₂与H₂O反应合成H₂CO₃，H₂CO₃释放游离的H⁺和HCO^-3，H⁺通过转运形成H⁺-ATPase，而H⁺-ATPase参与破骨细胞中的酸性骨基质脱矿过程[9]。Simone Carradori等[10]表明，碳酸酐酶2抑制剂能够调控骨形成与骨吸收动态平衡，具有预防骨质疏松症的作用。作者前期研究也发现二仙汤具有抗氧化的作用[4]。实验结果显示，与假手术组相比，模型组生物氧化相关蛋白表达上调。而与模型组相比，二仙汤组生物氧化相关蛋白表达显著下调，进一步提示二仙汤治疗骨质疏松症的作用机制可能与其下调生物氧化相关蛋白有关。

4.2 脂肪酸代谢相关蛋白

骨质疏松以骨量减少和骨结构破坏为特征，并伴随着骨髓中成骨细胞/脂肪细胞比值的改变，脂肪细胞增多促使脂肪形成，堆積在骨髓腔中抑制骨形成[11]。Sok Kuan Wong等表明[12]，脂代谢紊乱与骨质疏松密切相关，肥胖模型大鼠股骨和胫骨的骨矿物质含量与骨小梁参数较正常大鼠显著下降，脂肪组织中含有大量的激素和炎症细胞因子，例如白介素-1β（IL-1β），白介素-6 （IL-6），C-反应蛋白 （CRP），瘦素和脂联素，促炎症细胞因子通过刺激RANKL/RANK/OPG信号通路促进破骨细胞分化和骨吸收。实验结果显示，与假手术组相比，模型组脂肪酸代谢相关蛋白表达下调，说明模型组脂肪酸代谢受阻。而与模型组相比，二仙汤组脂肪酸代谢相关蛋白表达显著上调，提示二仙汤可能通过调节脂肪酸代谢，促进脂肪酸的氧化，减少脂质堆积达到治疗骨质疏松症的目的。

4.3 信号转导通路相关蛋白

Catherine D等[13]研究表明，细胞外基质-整合素构成的信号转导通路对于成骨细胞分化和矿化结节的形成是至关重要的，整合素β₁的表达水平上升能增强成骨细胞与细胞外基质的结合能力，影响细胞的生长、形态及功能，促使成骨细胞分化成熟。搜索Uniprot数据库Molecular Function发现，酪氨酸蛋白激酶SYK参与NF-κB，MAPK等多条信号转导通路，影响破骨细胞的分化成熟与功能发挥，具有调控骨吸收作用。酪氨酸蛋白激酶SYK的缺失会导致破骨细胞骨架结构紊乱，使骨吸收功能下降[14]。实验结果显示，与假手术组相比，模型组整合素β₁蛋白表达下调，酪氨酸蛋白激酶SYK表达上调。而与模型组相比，二仙汤组整合素β₁蛋白表达上调，酪氨酸蛋白激酶SYK表达下调，提示二仙汤可能通过调节相关信号转导通路蛋白，进而影响成骨细胞或破骨细胞的增殖分化。

4.4 细胞骨架相关蛋白

实验结果显示，与假手术组相比，模型组肌球蛋白-10、肌球蛋白-11、膜联蛋白A1、丝切蛋白-1等蛋白表达下调，表明模型组大鼠细胞骨架蛋白遭到破坏。而与模型组相比，二仙汤组肌球蛋白-10、肌球蛋白-11、膜联蛋白A1、丝切蛋白-1等蛋白表达显著上调，提示二仙汤能够调节去卵巢骨质疏松模型大鼠细胞骨架蛋白，对细胞具有保护作用。

综上所述，二仙汤具有防治骨质疏松的作用。以蛋白质组学技术对骨组织进行分析，初步确认二仙汤干预去卵巢骨质疏松大鼠后股骨组织的差异蛋白，如碳酸酐酶2、整合素β1等，这些差异蛋白质可能是二仙汤防治骨质疏松症的靶点蛋白，也将在今后的研究中进一步对差异蛋白质进行验证。

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[責任编辑 张宁宁]