翡翠贻贝不同醇沉物体外抗氧化活性研究

刘淑集，罗钦钦，潘裕添，刘智禹，苏永昌，林娇芬，陈锦权

1(福建农林大学 食品科学学院，福建 福州，350002) 2(福建省水产研究所， 福建 厦门，361013)3(闽南师范大学 菌物工程技术研究中心，福建 漳州，363000)4(福建省海洋生物增养殖与高值化利用重点实验室，福建 厦门，361013)

翡翠贻贝不同醇沉物体外抗氧化活性研究

刘淑集1,2，4，罗钦钦3，潘裕添3，刘智禹2，4，苏永昌2，4，林娇芬3，陈锦权1*

1(福建农林大学 食品科学学院，福建 福州，350002) 2(福建省水产研究所， 福建 厦门，361013)3(闽南师范大学 菌物工程技术研究中心，福建 漳州，363000)4(福建省海洋生物增养殖与高值化利用重点实验室，福建 厦门，361013)

翡翠贻贝；分级;醇沉；抗氧化

自由基，是人体生命过程中生化反应产生的中间产物，种类非常多。但是过多的自由基会对人体产生攻击，且攻击途径是多方面的，会引起人体细胞、分子甚至器官受损，导致病变，从而产生各种各样的疑难杂症[1]。因此为了防止机体受到自由基损伤，各种抗氧化保健品的研究成为了人们的研究热点[2]。然而由于很多工业上的抗氧化剂是人工合成，对人体产生一定的毒性。因此，利用我国丰富的资源寻求天然的、对人体无毒害的抗氧化剂成为了当下抗氧化科学研究领域的重要突破口。

迄今为止，人们对海洋生物资源的开发和糖类药物的研究不断增多，已有研究表明，贝类中的糖复合物是贝类体内一种含量丰富的生物活性物质，是创新型药物和功能型保健食品的重要资源，具有良好的应用前景。例如具有抗衰老作用的波纹巴非蛤多糖、文蛤多糖等；具有抗肿瘤作用的牡蛎多糖、珠母贝糖胺聚糖等；具有抗病毒作用的牡蛎糖胺聚糖、扇贝裙边糖胺聚糖等[3]。翡翠贻贝(Pernaviridis)是海产双壳贝类，俗称海虹，广泛分布在我国福建、浙江，山东，辽宁等沿海地带，其味道鲜美，营养丰富。苏颂的《本草图经》记载，其有“补五脏，益阳事，消宿食”等功效，现代研究表明，贻贝中多种活性物质具有抗菌、抗肿瘤、抗衰老、增强免疫力等作用且安全无毒害[4]，因而在临床的应用中将会有越来越广泛的前景。因此，本文通过采用不同体积分数乙醇分级沉淀翡翠贻贝提取物，获得不同醇沉物，并比较不同组分在体外化学体系中对清除DPPH自由基、超氧阴离子自由基(·O2-)、羟自由基(·OH)、总抗氧化能力及抑制肝组织自发性脂质过氧化作用(LPO)的影响，研究其抗氧化活性，旨在为翡翠贻贝功能性食品及天然抗氧化剂的开发提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

翡翠贻贝(Pernaviridis)：购自厦门市东渡水产品市场，活贝购回后立即取肉、匀浆、均质、分装，-18 ℃冷冻备用。

KM小鼠，SPF级，体重(20±2) g，雄性，购自中国科学院上海生命科学研究院(动物中心)上海斯莱克实验动物有限责任公司(动物许可证号：SCXK(沪)2014-0002)，饲养环境温度为(22±2) ℃，光照12 h/日，自由取食和饮水，适应环境饲养7 d。

基础饲料，购自中国科学院上海生命科学研究院(动物中心)上海斯莱克实验动物有限责任公司。

1.2 主要试剂

抗坏血酸、邻苯三酚(焦性没食子酸)、醋酸盐缓冲液、1,1-二苯-2-苦基肼(DPPH)、FeSO4、水杨酸-无水乙醇、硫代巴比妥酸(TBA)、三氯乙酸、FeCl3、磷酸盐缓冲液、三吡啶三吖嗪(TPTZ)、FeCl3、HCl、H2O2均为分析纯。

1.3 仪器与设备

UV-2102 PC型紫外可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；BS 124 S型电子分析天平，德国Sartorius公司；PRO 200型组织匀浆器，美国PRO Scientific公司；Centrifuge 5810 R型高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；50型胶体磨，郑州长城科工贸有限公司；SPX-250 B-Z型生化培养箱，上海博迅实业有限公司；BCD-216 TX型电冰箱，青岛海尔股份有限公司；HH-2型数显恒温水浴锅，金坛市科析仪器有限公司；LG-0.2型真空冷冻干燥机，上海沃迪科技有限公司；TC 101型电热鼓风干燥箱，上海一恒科技有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 翡翠贻贝不同醇沉物的制备[4-5]及其成分分析

取于-18 ℃低温贮藏的翡翠贻贝均质匀浆液若干袋，称其质量m克，放入烧杯中，加入等质量的水，于60 ℃恒温水浴浸提1.5 h，离心取上清液，加入无水乙醇，使其终浓度为45%，-20 ℃静置12 h，8 000 r/min离心10 min，沉淀即为45%乙醇提取物，命名为ME45，上清液继续加入无水乙醇进行分级沉淀，分别得到ME60和ME80翡翠贻贝提取物。

将得到的3种翡翠贻贝醇沉物冻干备用。采用苯酚硫酸法测定总糖含量，凯氏定氮法测定总氮含量；GB 5009.3—2010直接干燥法测定水分含量；GB 5009.4—2010灼烧称重法测定灰分含量；硫酸钡比浊法测定硫酸根含量。

1.4.2 总抗氧化活力的测定——FRAP(ferric reducing antioxidant power)法[6-7]

FRAP工作液的配制：0.3 mol/L的醋酸盐缓冲液(pH 3.6) 25 mL、10 mmol/L的TPTZ溶液(用40 mmol/L HCl配制)2.5 mL、20 mmol/L FeCl3溶液2.5 mL。用前37 ℃预热。

FeSO4的标准曲线的绘制：以0.01～0.1 mmol/L FeSO4的标准溶液，用蒸馏水补足到2.0 mL，加入FRAP工作液3.0 mL混匀，置于37 ℃恒温水浴反应10 min，测定OD593nm，重复3次，计算其平均值，绘制标准曲线。

在试管中加入2.0 mL一定浓度的样品水溶液，后按上述方法测定翡翠贻贝不同醇沉物的的OD593nm值。抗氧化活性以相同吸光度值的FeSO4浓度表示。

1.4.3 对DPPH自由基清除能力的测定

DPPH自由基清除能力的测定参照SHANKAR[8]的方法并进行改进。在试管中加入1.0 mL一定浓度的样品水溶液，再加入4.0 mL DPPH 溶液(0.1 mmol/L，用无水乙醇配制)，充分混合均匀，室温下静置30 min，然后测定OD517 nm吸光值，记作A，用无水乙醇替代DPPH，测吸光值为A1，以蒸馏水代替样品溶液，测吸光度为A0。以VC作为标准对照。

(1)

式中：C1,样品对DPPH自由基的清除率,%;A0,空白管的吸光值;A,加入样品后的吸光值;A1,未加DPPH样品溶液本底的吸光值。

1.4.4 对超氧阴离子自由基(·O2-)清除能力的测定

·O2-清除能力的测定方法参照范秀萍[9]的方法并进行改进。在试管中加入1.0 mL蒸馏水，3.5 mL 0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 8.04)，0.5 mL 10 mmol/L邻苯三酚溶液，立即迅速混匀，测定OD325nm，30 s后开始记录数据A1，每过30 s记录一次吸光值，直到3.5 min(A2)，用10 mmol/L的盐酸代替邻苯三酚作为空白对照，计算邻苯三酚自氧化速率。吸取一定浓度的的样品水溶液1.0 mL，按照上述方法，测定加入样品后的OD325nm，并计算加样后邻苯三酚自氧化速率。测定VC作为标准对照。

(2)

(3)

式中：A1,第30 s的吸光值；A2,第3.5 min的吸光值；S0，邻苯三酚自氧化速率；S1，加样后邻苯三酚自氧化速率；C2，样品对·O2-的清除率,%。

1.4.5 对羟自由基(·OH)清除能力的测定

清除羟自由基(·OH)能力测定参照MOHAMMADA[10]方法进行改进。在试管中加入一定浓度的样品水溶液1.0 mL，然后加入9 mmol/L水杨酸-无水乙醇、8.8 mmol/L H2O2、和9 mmol/L FeSO4各0.5 mL，充分混匀，置于37 ℃恒温水浴0.5 h，测定OD510nm吸光值，记为A，用蒸馏水代替H2O2，测定吸光值为A1，以蒸馏水代替样品溶液，测定吸光值为A0，以VC作为标准对照。

(4)

式中：C3，样品对·OH 的清除率,%;A，加样后溶液的吸光值;A0，空白管的吸光值;A1，未加入的样品溶液的吸光值。

1.4.6 体外抗肝组织自发性脂质过氧化的测定[11]

小白鼠禁食隔夜16 h 后处死，迅速取肝脏，用4 ℃生理盐水清洗擦干，冰浴下匀浆，制成10%的肝组织液。在试管中加入一定浓度的样品水溶液，然后加入1.0 mL的肝组织液液，充分混匀，置于37 ℃水浴3 h，后立即加入1.5 mL浓度为20%的三氯乙酸，混匀，3 500 r/min离心10 min。取3.0 mL上清液，加入1.5 mL 0.67%的TBA，置于90 ℃水浴15 min，后冷却离心，测定上清液的OD532 nm。对照组用不加样品水溶液，以生理盐水代替；空白组不加样品水溶液和肝脏组织液。计算肝组织脂质过氧化(LPO)的抑制率。

(5)

式中：C4，LPO抑制率,%;A，对照组的吸光值，Ai，各样品组的吸光值。

1.4.7 数据处理

2 结果与讨论

2.1 翡翠贻贝不同醇沉物的成分分析

乙醇分级沉淀体系，与物质的分子质量及极性有关。低浓度的乙醇能沉淀出黏液质、淀粉、高分子质量蛋白质等大分子物质，随着乙醇浓度的升高，分子质量较小的物质逐渐沉淀出来，当体积分数达到90%以上时，几乎可以沉淀出所有的多糖、蛋白质和无机盐等小分子[12]。通过加入不同体积分数的乙醇沉淀翡翠贻贝粗提物获得ME45、ME60和ME80三种翡翠贻贝醇沉物。分别测定其总氮、总糖、硫酸根、水分、灰分等基本成分，结果见表1。结果表明，3种醇沉物均含有蛋白质、多糖、硫酸酯等物质。ME45、ME60和ME80的蛋白质与多糖之和分别为71.91%、73.79%和74.14%。蛋白质与多糖含量之和以及所有测试项目之和均随着乙醇浓度的升高而增加，说明通过由低到高的乙醇浓度的分级沉淀之后，醇沉物的纯度也随着提高。醇沉物ME80中的多糖含量最高，且硫酸根含量是前面2个组分的10倍，说明该组分中的多糖的硫酸化程度高，含有较多的多糖硫酸酯。同时，ME80的灰分含量最高，是由于高浓度的乙醇将无机盐等小分子物质一并沉淀。

表1 翡翠贻贝不同醇沉物的成分分析 单位：%

2.2 体外抗氧化活性的检测

2.2.1 总抗氧化活力的检测

一般情况下，抗氧化剂通过自身还原作用给出电子达到清除自由基的目的[13]，因此其还原力越强，它的抗氧化能力也就越强。Fe3+-TPTZ在酸性条件下可被还原为Fe2+-TPTZ而呈蓝色，在593nm处有最大吸光值。因此，根据吸光值的大小可判定总抗氧化能力的大小。

a：标准曲线；b：ME 80，ME60和ME45的总抗氧化能力图1 翡翠贻贝不同醇沉物的总抗氧化能力的测定Fig.1 Total antioxidative capacity of differnet EtOH deposition fractions from P. viridis extract

从图1-a标准曲线图可以看出，FeSO4浓度在0～0.1 mmol/mL内与吸光值的线性关系良好，回归方程式为y=9.831 5x+0.019 5，R2=0.996 6，这与江慎华、HUANG、董晓静等研究一致[3, 12-13]。由图1-b可以看出，ME45，ME60和ME80的总抗氧化能力基本与其质量浓度呈现正相关，当浓度达到16 mg/mL后，3种样品的总抗氧化能力已经基本趋于平缓。通过总抗氧化能力的测定结果，可以看出ME60和ME80总抗氧化能力要优于ME45，且存在最佳的浓度范围。3种不同体积分数乙醇分级醇沉的提取物均具有一定的总抗氧化活力，为其清除自由基或具备抗氧化作用奠定一定的基础。

2.2.2 对DPPH自由基清除能力的检测

由图2-a可知，Vc在0.1～1.0mg/mL质量浓度呈显著的量效关系，当Vc浓度达1.0mg/mL时清除率几乎达到100%。由图2-b可以看出，翡翠贻贝3种不同体积分数乙醇沉淀物ME45、ME60和ME80对DPPH自由基均有清除作用，且随着浓度的增加，清除率明显提高，呈明显的量效关系。在相同浓度下，ME60对DPPH自由基的清除率最大，其次是ME80，ME45最小。当浓度为20 mg/mL时，ME80、ME60、ME45的清除率分别为60.23%，73.98%，34.78%，其拟合曲线方程式分别为y=9.789 3 Ln(x)-1.357 9，R2=0.897 0；y=22.731Ln(x)+0.024 6，R2=0.883 8；y=19.418Ln(x)-6.917 1，R2=0.890 4，根据曲线方程式计算IC50分别为16.55、9.01、34.17 mg/mL。因此，结果表明ME80、ME60对DPPH自由基具有一定的清除作用，ME60的样品对DPPH自由基的清除能力优于ME80(P<0.01)，ME45对DPPH自由基的清除能力较弱。

a：Vc；b：ME 80，ME60和ME45清除DPPH自由基的能力图2 翡翠贻贝不同醇沉物及Vc对DPPH自由基的清除能力Fig.2 Scavenging effect of Vc and differnet EtOH deposition fractions from P. viridis on DPPH

2.2.3 对超氧阴离子自由基(·O2-)清除能力的检测

翡翠贻贝3种不同体积分数乙醇沉淀物ME45、ME60和ME80对·O2-的清除作用如图3所示。Vc对·O2-的清除作用高于翡翠贻贝不同体积分数乙醇提取物。由图3-b可以看出，ME45、ME60和ME80对·O2-均具有清除能力，且呈显著的量效关系。当浓度达16 mg/mL时，ME80对·O2-的清除率达到最大，为99.78%，ME60和ME45的清除率分别为70.03%、51.98%。ME80、ME60和ME45的清除率拟合曲线方程式分别为y=31.501Ln(x)+7.195 1，R2=0.978 6；y=31.850Ln(x)-20.022，R2=0.965 5；y=26.882Ln(x)-23.947，R2=0.898 7。根据曲线方程式计算ME80，ME60和ME45清除·O2-的IC50分别为3.89、9.01、15.66 mg/mL。因此表明，ME80、ME60和ME45对·O2-具有一定的清除作用，ME80对的清除能力优于ME60和ME45(P<0.01)。

a：Vc；b：ME 80，ME60和ME45清除·O2-的能力图3 翡翠贻贝不同醇沉物及Vc对·O2-的清除能力Fig.3 Scavenging effect of Vc and differnet EtOH deposition fractions from P. viridis on·O2-

2.2.4 对羟自由基(·OH)清除能力的检测

由图4-a可以看出，Vc为0.05～0.3 mg/mL呈显著的量效关系。当Vc浓度达0.3mg/mL时清除率几乎达到100%，说明Vc具有显著的清除羟自由基能力。由图4-b可以看出，翡翠贻贝3种不同体积分数醇沉物ME45、ME60和ME80对·OH均有清除作用，且随着浓度的增加，清除率明显提高，显著正相关。当浓度大于3 mg/mL，ME80和ME45对·OH的清除率相差不大，增速减缓。当浓度为5 mg/mL时，ME80、ME60和ME45对·OH的清除率分别为98.37%、63.81%、98.53%，其拟合曲线方程式分别为y=41.517Ln(x)+33.660，R2=0.953 8；y=24.697Ln(x)+21.279，R2=0.933 5；y=25.128Ln(x)+58.481，R2=0.984 2。根据曲线方程式计算IC50分别为0.39、3.20、0.71 mg/mL。结果表明ME80、ME60和ME45对·OH具有一定的清除作用，ME45的清除能力优于ME80和ME60(P<0.01)。

2.2.5 对肝组织自发性脂质过氧化的检测

脂质过氧化作用是指多不饱和脂肪酸和脂质氧化变质，形成脂质过氧化产物从而对脂蛋白、细胞膜等其它含脂质结构造成严重损害[11]。由图5可知，Vc对体外抑制肝组织自发性脂质过氧化的作用高于翡翠贻贝不同体积分数乙醇沉淀物。随着翡翠贻贝不同醇沉物浓度的增加，对体外抗肝组织自发性脂质过氧化的抑制作用越强，且呈明显的正相关效应。ME80的抑制作用明显高于ME60和ME45，ME60和ME45的抑制作用相差不大。当ME80浓度达到20 mg/mL时，对LPO的清除率达85.75%，仍然有持续上升的趋势；当ME60浓度达18 mg/mL时，对LPO的清除率达到最大，为44.85%；ME45在浓度为16 mg/mL时对LPO的清除率达到最大，为36.25%。上述结果表明，翡翠贻贝不同醇沉物具有抑制肝组织自发性脂质过氧化的作用，ME80的抑制率优于ME60和ME45(P<0.01)。

a：Vc；b：ME 80，ME60和ME45清除·OH的能力图4 翡翠贻贝不同醇沉物及Vc对·OH的清除能力Fig.4 Scavenging effect of Vc and differnet EtOH deposition fractions from P. viridis on·OH

a：Vc；b：ME 80，ME60和ME45清除LPO的能力图5 翡翠贻贝不同醇沉物及Vc对LPO的清除能力Fig.5 Scavenging effect of Vc and differnet EtOH deposition fractions from P. viridis on LPO

3 结论

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Studies on antioxidative activitiesinvitroof the extracts by different EtOH precipitation fromPernaviridis

LIU Shu-ji1,2，4, LUO Qin-qin3, PAN Yu-tian3, LIU Zhi-yu2，4, SU Yong-chang2，4, LIN Jiao-fen3, CHEN Jin-quan1*

1(College of Food Science, Fujian Agriculture and Forestry University 350002, China)2(Fisheries Research Institute of Fujian, Xiamen 361013, China)3(Engineering Technological Center of Mushroom Industry,Minnan Normal University, Zhangzhou 363000,China)4(Key Laboratory of Cultivation and High-value Utilization of Marin Organisms in Fujian Province, Xiamen 361013,China)

In this paper, three extracts named ME45, ME60 and ME80 were precipitated by 45%, 60% and 80% EtOH fromPernaviridisrespectively. Their antioxidant activities were compared by scavenging activities for 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radicals, superoxidized radicals (·O2-), hydroxyl radicals (·OH), total antioxidant activities (TAC), and inhibitory effect on lipid peroxidation (LPO)invitro. The results showed that all precipitations had antioxidant activities and were dose-dependent. Different antioxidant activities were shown among different reaction systmes of three fractions. In TAC, ·O2-,and LPO reaction systems, the antioxidant activities order was: ME80>ME60>ME45. ME60 fraction had better scavenging effects than ME80 and ME45 for DPPH·. In the scavenging ·OH system, the order of removing ability was :ME45>ME80>ME60. In conclusion, ME80 fraction showed relatively strong antioxidant activities, a good potential as a natural antioxidant, and worth of further exploration and application.

P.viridis; extractives; ethanol fractional precipitation; antioxidant

博士研究生(陈锦权教授为通讯作者,E-mail: chenjq6613@gmail.com)。

福建省省属公益类科研院所基本科研专项(2014R1003-9)；福建省海洋高新产业发展专项(闽海洋高新[2014]20号)

2015-03-18，改回日期：2015-12-30

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201706031