植物乳杆菌JLA-9产细菌素的分离纯化

赵圣明，赵岩岩，马汉军

(河南科技学院 食品学院，河南 新乡，453003)

植物乳杆菌JLA-9产细菌素的分离纯化

赵圣明*，赵岩岩，马汉军

(河南科技学院 食品学院，河南 新乡，453003)

将来源于东北传统发酵酸菜中的植物乳杆菌JLA-9产的细菌素进行分离纯化，首先利用饱和度为80%的硫酸铵溶液对发酵上清液进行沉淀粗分离。复溶后利用Sephadex LH-20进行凝胶层析纯化，之后采用Hitrap QFF进一步进行离子交换层析纯化，利用反相高效液相色谱(Reversed-Phase High Performance Liquid Chromatography，RP-HPLC)C18柱进行最终纯化，得到单一活性抑菌组分，说明细菌素得到基本纯化，经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time of Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF/MS)确定该细菌素的分子质量约为0.9 kDa左右。采用琼脂扩散法测定了细菌素对常见的食源性致病菌和腐败菌的抑菌效果，结果显示该细菌素具有较好的抑制作用。

植物乳杆菌；细菌素；分离；纯化；分子质量

植物乳杆菌作为一种重要的乳酸菌，目前已经被广泛的应用到食品加工相关领域中[1]。许多植物乳杆菌能够产生细菌素，且细菌素具有热稳定性高，耐酸，抑菌谱广以及能够被蛋白酶降解等优点，已经成为食品行业生物防腐剂开发的一个热门方向[2-3]。目前从发酵食品中已经获得多种植物乳杆菌产的细菌素，例如plantaricin 163[4]，plantaricin A-1[5]，plantaricin 35d[6]，bacteriocin AMA-K[7]，plantaricin MG[8]以及plantaricin ZJ5[9]等。有的植物乳杆菌产的细菌素抑菌谱较广，对革兰氏阳性菌和阴性菌都具有抑制效果，如分离自泡菜中的植物乳杆菌163产的细菌素plantaricin 163对食品中常见的大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，蜡样芽孢杆菌等均具有较好的抑菌作用[4]。但有的细菌素抑菌谱却很窄，仅能抑制少数种类的细菌，例如从山羊奶中分离获得的植物乳杆菌 LC74产的细菌素plantaricin LC74，仅能够抑制植物乳杆菌，短乳杆菌和布氏乳杆菌[10]。

细菌素的分离纯化主要是根据细菌素的带电性、分子质量大小及疏水性等特点来进行。一般的纯化主要包括3个基本的步骤：即粗提取、初步纯化和精细纯化。粗提取大部分都是采用盐析的方法，主要是在发酵上清液中加入无机盐，最常用的是硫酸铵，使蛋白类细菌素的溶解度降低从而从液体中析出。SOUMAYA等利用盐析的方法从唾液乳杆菌 SMXD51的发酵液中对细菌素进行粗分离，取得了很好的效果，回收率为1.36%[11]。RAMAKRISHNAN等利用硫酸铵沉淀粗分离鼠李糖乳杆菌 L34产的细菌素，得到了较好的分离效果[12]。也有少部分人选用有机溶剂进行萃取，主要是利用细菌素在互不相溶或者微溶的发酵上清液和有机溶剂中溶解度的不同，从而使细菌素从发酵上清液中转移到有机溶剂中，然后将有机溶剂通过真空旋转浓缩除去，最后得到粗提的细菌素，如TAYLOR等利用甲醇和乙醇提取nisin取得了较好的分离效果[13]。初步纯化一般主要目的是除去大部分的杂质，使细菌素的纯度达到50%～90%，用于进一步的纯化鉴定，通常采用离子交换层析和凝胶层析等方式进行纯化。由于乳酸菌产的细菌素一般所带的电荷大小不同，因此选用离子交换层析能够达到对细菌素分离纯化的目的，该方法具有操作简单及交换容量大等特点，已经成为细菌素纯化过程中的最常用的方法之一。ZHU等利用离子交换层析结合凝胶层析的方法，以0.15 mol/L NaCl 进行洗脱分离得到植物乳杆菌 ZJ008产的细菌素plantaricin ZJ008，纯化倍数达到24.8[14]。HATA等采用离子交换和凝胶层析对植物乳杆菌 A-1产的细菌素plantaricin ASM1进行分离，纯化倍数达到20倍[15]。一般精细纯化作为整个纯化的最后一步，目的是除去样品中残留的痕量杂质，是样品中的纯度高于99%，以便于采用质谱和氨基酸测序等手段对其结构进行鉴定。目前大部分纯化实验的最后一步都是采用反相高效液相色谱法，它可以显著地提高样品的纯度，因此反相高效液相色谱技术已经在细菌素纯化中得到了广泛的应用[14-16]。

本课题组前期从东北传统发酵酸菜中分离得到1株植物乳杆菌JLA-9，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有较强的抑制作用。本研究拟选用硫酸铵沉淀，凝胶柱层析，离子交换层析和反相高效液相色谱等分离纯化手段对植物乳杆菌JLA-9产的细菌素进行分离纯化，为深入研究其结构及性质提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

植物乳杆菌JLA-9，本实验室分离自吉林省蛟河市农家自制发酵酸菜，现已保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC No.10686)。

指示菌菌株及来源：大肠杆菌(ATCC25922)、蜡样芽孢杆菌(AS1.1846)、荧光假单胞菌(AS1.1802)、藤黄微球菌(CMCC(B)2800)、枯草芽孢杆菌(ATCC9943)和肠炎沙门氏菌(CICC21527)。

MRS培养基：牛肉膏10 g，蛋白胨10 g，乙酸钠5 g，K2HPO42 g，柠檬酸氢铵2 g，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O0.25 g，葡萄糖20 g，吐温-80 1 mL，蒸馏水1 L，pH 6.2～6.4，115 ℃、20 min灭菌备用，固体培养基另加1.5%～2%的琼脂。LB培养基：酵母粉5 g，蛋白胨10 g，NaCl5 g，蒸馏水1 L，pH 7.0，121 ℃、20 min灭菌备用，固体培养基另加1.5%～2%的琼脂。

Sephadex LH-20，美国Phamarcia公司；乙腈、三氟乙酸(TFA)、甲醇：色谱纯，美国Tedia公司；硫酸铵：分析纯，国药集团化学试剂公司。

1.2 仪器与设备

全自动高压灭菌锅TOMY-SX-70，日本Tomy公司；高速离心机5418，芬兰Eppendorf公司；pH计Orion 3 STAR，美国Thermo公司；超净工作台SW-CJ-IBU，苏州苏净集团；冷冻干燥机，德国Christ公司；AKTA蛋白纯化系统、Hitrap QFF离子交换层析柱，GE Healthcare公司；分光光度计UV-2450，日本Shimadzu公司；旋转蒸发仪，德国Heidolph公司；高效液相色谱仪Agilent 1100 series，美国Agilent公司；基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪，德国Bruker公司；电脑自动部分收集器DBS-100，上海沪西分析仪器公司。

1.3 方法

1.3.1 细菌素粗提液的制备

将植物乳杆菌 JLA-9在试管斜面MRS琼脂培养基上活化后接种于MRS液体培养基，培养至对数生长期，制成浓度为107～108CFU/mL的种子液。将植物乳杆菌JLA-9种子液以1%浓度接种于MRS发酵培养基中， 37 ℃静止培养36 h，得到细菌素发酵液后离心除去菌体得到无细胞上清液。将该上清液分为4组，分别经60%、70%、80%、90%饱和硫酸铵搅拌过夜后，9 000 g离心10 min收集沉淀。用1/30体积的去离子水复溶后，用1 mol/L NaOH调至pH6.5，经5.0 g/L的过氧化氢酶37 ℃处理2 h后即为获得的细菌素粗提物。

1.3.2 细菌素抑菌圈直径的测定

细菌素抑菌圈直径的测定采用琼脂孔扩散法[17]，以蜡样芽孢杆菌AS1.1846作为指示菌。

1.3.3 凝胶层析纯化细菌素

采用Sephadex LH-20凝胶层析对细菌素的粗提物进行层析纯化。纯化条件为：将2 mL细菌素粗提液上样于Sephadex LH-20柱表面，采用色谱甲醇和纯水(体积比为80：20)进行洗脱,洗脱流速3 mL/min，利用电脑自动收集器收集组分[4]。以蜡样芽孢杆菌作为指示菌，通过检测其抑菌活性，得到抑菌活性组分。

1.3.4 离子交换层析纯化细菌素

采用Hitrap QFF离子交换层析柱，利用AKTA蛋白纯化系统对Sephadex LH-20纯化得到的活性组分进行层析纯化。纯化条件为：流速2 mL/ min, 最高柱压0.3 MPa, 收集体积为1 mL, 洗脱体积为5个柱体积, 平衡体积为5个体积, 进样2 mL。分别用0.1 mol/L，0.25 mol/L，0.4 mol/L，1 mol/L的NaCl (pH8.5的 Tris-Hcl作为缓冲液)进行梯度洗脱。255 nm 紫外光下检测，收集各个洗脱组分，经蒸馏水透析脱盐后通过测定抑菌圈直径检测其抑菌活性。

1.3.5 反相高效液相色谱纯化细菌素

将经过Hitrap QFF离子交换层析纯化得到的活性组分经浓缩后采用反高效液相色谱Acchrom XCharge C18柱(4.6 mm×250 mm)进行分离纯化，纯化条件：洗脱液为含0.1%体积的三氟乙酸的水和乙腈溶液(水和乙腈体积比为95∶5)等浓度洗脱，时间：50 min；进样量: 20 μL；流速：0.3 mL/min；检测波长：255 nm。收集液相色谱洗脱组分，通过测定抑菌圈直径检测其抑菌活性。

1.3.6 细菌素分子质量测定

采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS) 对RP-HPLC最终纯化得到的单一抑菌活性组分进行细菌素分子质量测定：仪器为Re Flex TM MALDI-TOF质谱仪；质谱基质为α-氰基-4-羟基肉桂酸[18]；质谱条件：激光源为波长355 nm的Nd YAG激光器，加速电压20 kV，激光强度4 100，正离子模式检测，线性高分子模式，质量扫描范围m/z700～3 500。

1.3.7 细菌素抑菌活性测定

采用经Sephadex LH-20部分纯化获得的细菌素活性组分，利用琼脂孔扩散法测定细菌素的抑菌活性，指示菌株包括：大肠杆菌(ATCC25922)、蜡样芽孢杆菌(AS1.1846)、荧光假单胞菌(AS1.1802)、藤黄微球菌(CMCC(B)2800)、枯草芽孢杆菌(ATCC9943)和肠炎沙门氏菌(CICC21527)。

2 结果与分析

2.1 细菌素硫酸铵沉淀粗提取

本试验中分别选用60%、70%、80%、90%饱和度的硫酸铵进行沉淀，由表1可以看出80%和90%饱和硫酸铵沉淀的效果较好，由于90%饱和硫酸铵沉淀下来的杂蛋白会更多，因此选用80%饱和硫酸铵沉淀作为细菌素的粗提取方法。

表1 植物乳杆菌 JLA-9发酵上清液硫酸铵沉淀后抑菌活性

2.2 细菌素凝胶层析纯化

经硫酸铵沉淀得到的细菌素粗提样品首先采用Sephadex LH-20凝胶层析进行纯化，以蜡样芽孢杆菌AS1.1846作为抑菌指示菌，通过琼脂孔扩散法对收集的样品进行检测，结果见图1。由图1可以看出，在收集管中的第36管至49管之间得到一个抑菌活性洗脱组分，因此将其收集后用于下一步分离纯化。

图1 植物乳杆菌JLA-9所产细菌素的Sephadex LH-20洗脱曲线Fig.1 Elution curve of bacteriocin from L. plantarum JLA-9 on Sephadex LH-20 gel

2.3 细菌素离子交换层析纯化

将经Sephadex LH-20纯化得到的样品进行Hitrap QFF离子交换层析纯化，以蜡样芽孢杆菌作为抑菌指示菌，通过琼脂孔扩散法对收集的样品进行检测，结果见图2。经抑菌实验检测，在NaCl的洗脱浓度为0.1mol/L时得到的洗脱组分1具有抑菌活性，在第16管至24管之间得到该抑菌活性组分，将其收集后用于下一步的分离纯化。

图2 植物乳杆菌JLA-9所产细菌素的Hitrap QFF Fast Flow洗脱曲线Fig.2 Elution curve of bacteriocin from L. plantarum JLA-9 on Hitrap QFF Fast Flow gel

2.4 细菌素反相高效液相色谱纯化

由Hitrap QFF离子交换层析纯化得到的抑菌活性洗脱组分经浓缩后利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)进一步纯化结果见图3。

图3 植物乳杆菌JLA-9产细菌素的RP-HPLC图Fig.3 RP-HPLC of bacteriocin produced by L. plantarum JLA-9

由图3可知，在保留时间为14.879 min时得到一个对蜡样芽孢杆菌具有抑菌活性的洗脱组分，将该抑菌活性组分收集后用于下一步的分子量测定分析。

2.5 细菌素分子量测定

将经RP-HPLC保留时间为14.879 min的抑菌活性组分收集后浓缩，利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)进行质谱分析，测定细菌素的分子量，结果见图4。由图4可知，出现多个质谱峰，说明样品中仍存在多种物质，这可能由于前面的分离纯化效果不佳，但是主要质谱峰都是集中在0.9 kD左右，初步可以判断植物乳杆菌JLA-9产细菌素的分子量约为0.9 kD左右，可以根据分子量测定结果，进一步选用合适的纯化方法对细菌素进行分离纯化。

图4 植物乳杆菌JLA-9所产细菌素的MALDI-TOF质谱图Fig.4 MALDI-TOF MS of bacteriocin produced by L. plantarum JLA-9

2.6 细菌素的抑菌活性

经RP-HPLC纯化得到的细菌素对常见的一些食源性致病菌及腐败菌均具有较好的抑制作用。如图5所示。

a：荧光假单胞菌；b：大肠杆菌；c：藤黄微球菌 d：蜡样芽孢杆菌；e：枯草芽孢杆菌；f：肠炎沙门氏菌图5 植物乳杆菌JLA-9产细菌素的抑菌活性Fig 5. The antibacterial activity of active bacteriocin from L. plantarum JLA-9

植物乳杆菌JLA-9产的细菌素对荧光假单胞菌、大肠杆菌、藤黄微球菌、蜡样芽孢杆菌菌、枯草芽孢杆菌和肠炎沙门氏菌具有明显的抑制效果。

3 讨论

本研究从东北传统发酵酸菜中分离得到一种细菌素，分子量大约在0.9 kDa左右，对食品中常见的一些食源性致病菌及腐败菌具有较好的抑制作用。这与一些已经报道的植物乳杆菌产的细菌素具有相似的抑菌活性，如plantaricin 163对食品中常见的大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，蜡样芽孢杆菌等均具有较好的抑菌作用[4]，Plantaricin MG主要对革兰氏阴性食源性致病菌具有较好的抑制作用，但也能抑制一些革兰氏阳性致病菌如枯草芽孢杆菌等[8]。到目前为止已经有许多植物乳杆菌产的细菌素被报道，其分子量一般都在1 k～5kDa之间，如植物乳杆菌 ZJ008产的plantaricin ZJ008分子量为1.3 kDa[14]， 植物乳杆菌 NRIC 149产的plantaricin 149分子量为2.2 kDa[19]，植物乳杆菌423产的plantaricin 423分子量为3.5 kDa[20]，植物乳杆菌C19产的plantaricin C19分子量为3.8 kDa[21]，植物乳杆菌510产的plantaricin Y分子量为4.2 kDa[22]等。本研究获得的细菌素在分子量在0.9 kDa左右，有可能为一种新的细菌素，以后的研究将对分离纯化工作进行优化，进一步对该细菌的结构及性质进行深入的研究。

本研究在离子交换层析纯化细菌素中，选用pH8.5的 Tris-Hcl作为缓冲液，分别以0.1、0.25、0.4、1 mol/L的NaCl进行梯度洗脱，实现较好的分离效果，获得细菌素的活性峰。一般在离子交换层析中，缓冲液的作用是维持待分离物质性质的稳定，同时保证待分离物质带上稳定的电荷从而更加容易结合离子交换介质上，由于不同物质带电荷不同，与交换介质结合能力也不同，通过盐溶液的梯度洗脱，可以将它们进行有效地分离。目前文献报道中一般多采用磷酸盐或者醋酸盐作为缓冲液，如ZHU等用Na3PO4和NaCl为洗脱缓冲液对plantaricin ZJ008进行分离纯化[14]，BAUER等用Na3PO4和NaCl为洗脱缓冲液分离纯化得到了Pediocin PD-1[23]，Deraz用NaAc和NaCl为洗脱缓冲液对Acidocin D20079 进行了分离纯化[24]。还有报道称王辉等采用超纯水和NaCl为洗脱缓冲液分离纯化得到了植物乳杆菌KLDS1.0391产的细菌素[25]。一般较少采用水作为离子交换层析的缓冲液，可能由于这种细菌素具有特殊的性质。本试验采用常用的磷酸盐和醋酸盐作为缓冲液所收集到的洗脱峰几乎没有洗脱峰，而采用Tris-Hcl作为缓冲液收集到的洗脱峰却抑菌活性较强，说明本试验纯化得到的细菌素与之前报道的细菌素可能具有一些不同的性质，具体原因尚不清楚，有待对其进行进一步的深入研究。

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Isolation and purification of bacteriocin produced byLactobacillusplantarum

ZHAO Sheng-ming*,ZHAO Yan-yan,MA Han-jun

(School of Food Science, Henan Institute of Science and Technology, Xinxiang 453003, China)

The bacteriocin produced byLactobacillusplantarumJLA-9 from fermented Chinese sauerkraut was purified. The cell-free supernatant ofLactobacillusplantarumJLA-9 was precipitated by ammonium sulfate and higher precipitation efficiency was obtained using 80% ammonium sulfate. Then, the samples were further purified by Sephadex LH-20 gel chromatography and Hitrap QFF ion exchange chromatography. The reverse-phase high-performance liquid chromatography with C18column was utilized for final purification. The bacteriocin produced byLactobacillusplantarumJLA-9 was essential purified to be a single peak by RP-HPLC chromatography. The molecular mass of purified bacteriocin was estimated by MALDI-TOF/MS to be approximately 0.9 kDa. The purified bacteriocin showed a high antibacterial activity against common food-borne pathogens and spoilage bacteria.

Lactobacillusplantarum; bacteriocin; isolation; purification; molecular mass

博士研究生，讲师(本文通讯作者，E-mail:Zhao.sheng ming@hist.edu.cn)。

河南省重大科技专项项目(161100110600)；河南科技学院高层次人才科研启动项目(2016018,2016019)；河南省高等学校重点科研项目(18B550003)

2016-11-29，改回日期：2017-02-09

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201706010