SSBP1在肝癌组织中的表达及意义

马荣芬 陈秋英 刘艳芬

·论著·

SSBP1在肝癌组织中的表达及意义

马荣芬 陈秋英 刘艳芬

目的 观察线粒体单链DNA结合蛋白(SSBP1)在肝癌组织的表达及意义。方法 收集2013年12月至2016年12月手术切除的肝癌患者组织标本80例，采用Real time-PCR和免疫组化SP法检测80例肝癌组织和癌旁组织SSBP1 mRNA和蛋白表达状况，分析其与临床病理参数的关系，并检测SSBP1在肝癌细胞株HepG2、MHCC97H、SMMC7721、Huh7及正常人肝细胞L-02的表达状况。结果 SSBP1在肝癌组织和癌旁组织的表达水平和阳性表达率分别为1.87±0.23、0.36±0.05和80.00%(64/80)、15.00%(12/80)，SSBP1在肝癌组织的表达水平和阳性表达率显著高于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05)。HepG2细胞中SSBP1表达水平显著高于MHCC97H、SMMC7721、Huh7及L-02细胞，差异有统计学意义(P<0.05)。且SSBP1表达与肿瘤大小、AFP、TNM分期、分化程度及有无门静脉癌栓、淋巴结转移密切相关(P<0.05)。结论 肝癌组织和细胞系高表达SSBP1，与临床病理参数有关，且SSBP1高表达提示预后不良。

肝癌；线粒体单链DNA结合蛋白；预后

肝癌是我国常见的消化系统恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率高居所有恶性肿瘤的第二位，仅次于肺癌[1,2]。肝癌手术切除后易复发，且对放化疗不敏感，患者预后差[3]。目前，靶向治疗为肝癌的临床治疗提供了新思路。因此，筛选有效的肿瘤标志物、明确肝癌发生发展的分子机制已经成为当前研究的热点，这对于肝癌治疗及预后评估至关重要。线粒体单链DNA结合蛋白(Mitochondria single-strand DNA protein 1，SSBP1)定位于线粒体基质和拟核，由148个氨基酸组成，主要在线粒体DNA(mtDNA)的复制、转录、损伤后修复过程中发挥关键作用。研究发现，SSBP1表达失调与乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌等恶性肿瘤关系密切[4-7]。但是，有关SSBP1在肝癌组织的表达状况及意义目前研究尚少。本研究采用Real time-PCR和免疫组化SP法检测SSBP1在肝癌组织和细胞系的表达状况，初步探讨SSBP1表达与临床病理参数和预后的相关性，旨在为寻找防治肝癌的有效靶点提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取我院2013年12月至2016年12月经肝胆外科手术切除的肝癌组织石蜡标本80例，术后均经病理确诊。癌旁组织取自来源于同一标本的距肿瘤边缘>2 cm的正常肝组织。其中男49例，女31例；年龄35～76岁，平均年龄(60.68±7.13)岁，≤60岁44例，>60岁36例；肿瘤直径≤5 cm 28例，>5 cm 52例；AFP≤200 μg/ml 30例，>200 μg/ml 50例；TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期37例，Ⅲ+Ⅳ期43例；分化程度：高+中分化35例，低分化45例；33例无门静脉癌栓，47例有门静脉癌栓；30例无淋巴结转移，50例有淋巴结转移。所有患者术前均未接受过放、化疗及生物治疗，临床病理资料完整。患者术后随访5年。

1.2 细胞、试剂与仪器 人肝癌细胞株(HepG2、MHCC97H、SMMC7721、Huh7)及正常人肝细胞L-02购自上海吉凯基因化学技术有限公司；RPMI 1640培养基购自美国Invitrogen公司；Trizol、实时荧光定量试剂盒购自美国Promega公司；兔抗人SSBP1购自美国Santa Cruz公司；免疫组化试剂盒购自日本Takara公司；Chemi DocTM XRS+化学发光凝胶成像系统购自美国Biorad公司；全自动7300型荧光定量PCR扩增仪购自美国ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫组化:采用免疫组织化学染色 SP法测定SSBP1表达，严格按照试剂盒说明书操作，用已知阳性切片作为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。判定标准：SSBP1阳性染色的判定标准为细胞质内检出棕黄色或棕褐色颗粒。在200倍光镜下随机选取5个有代表性的视野计数100个细胞，“-”：细胞无着色或<10%的细胞呈微弱着色；“+”：>10%的细胞呈微弱着色；“++”：>10%的细胞呈中度着色；“+++”：>10%的细胞呈完全着色。

1.3.2 细胞培养:人肝癌细胞株HepG2、MHCC97H、SMMC7721、Huh7及正常人肝细胞L-02用含10% FBS、1%青/链霉素的DMEM培养基在37℃、5% CO2、饱和湿度条件下常规培养。

1.3.3 Real time-PCR Trizol提取组织(或细胞)总RNA，分光光度计测定RNA浓度和纯度。采用Genne Tool 软件设计人SSBP1引物，由上海生工生物工程有限公司合成。按照试剂盒说明书加样进行逆转录反应，ABI 7300型荧光定量PCR仪扩增。用仪器自带的分析软件得到各样本、各基因扩增的Ct值，以β-actin为内参照基因，目的基因表达相对水平RQ=2△△Ct。见表1。

表1 Real time-PCR引物序列

1.4 观察指标 比较肝癌组织和癌旁组织SSBP1表达水平、阳性表达率的差异。比较4种肝癌细胞系(HepG2、MHCC97H、SMMC7721、Huh7)和正常人肝细胞SSBP1表达水平的差异。探讨SSBP1表达水平、阳性表达率与肝癌临床病理参数的关系。患者出院后随访5年，观察患者中位生存时间、生存率和复发率。

2 结果

2.1 SSBP1 mRNA在肝癌组织、癌旁组织的表达水平比较 Real time-PCR结果显示，SSBP1 mRNA在肝癌组织和癌旁组织的表达水平分别为1.87±0.23、0.36±0.05，SSBP1 mRNA在肝癌组织的表达水平显著高于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

组别SSBP1mRNA表达水平癌旁组织0．36±0．05肝癌组织1．87±0．23∗

注：与癌旁组织比较,*P<0.05

2.2 SSBP1蛋白在肝癌组织、癌旁组织的阳性表达率比较 免疫组化结果显示，SSBP1在肝癌组织和癌旁组织的阳性表达率分别为80.00%(64/80)、15.00%(12/80)，SSBP1在肝癌组织的阳性表达率显著高于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 SSBP1蛋白在肝癌组织、癌旁组织的的阳性表达率比较 n=80,例(%)

注：与癌旁组织比较,*P<0.05

2.3 SSBP1在肝癌细胞株、正常人肝细胞的表达水平比较 Real time-PCR和Western blot结果显示，SSBP1 mRNA和蛋白在肝癌细胞HepG2、MHCC97H、SMMC7721、Huh7的表达水平显著高于正常人肝细胞L-02，差异有统计学意义(P<0.05)。其中SSBP1在HepG2细胞表达水平最高。见表4。

类别SSBP1表达水平mRNA蛋白HepG22．16±0．30∗2．05±0．24∗MHCC97H1．45±0．22∗1．38±0．20∗SMMC77211．98±0．25∗1．83±0．22∗Huh71．60±0．20∗1．52±0．18∗L⁃020．83±0．110．76±0．09

注：与L-02比较,*P<0.05

2.4 SSBP1表达与肝癌临床病理参数的关系 SSBP1表达水平与肝癌患者性别、年龄无关，而与肿瘤大小、AFP、TNM分期、分化程度及有无门静脉癌栓、淋巴结转移密切相关(P<0.05)。其中肿瘤大小≤5 cm、AFP≤200 μg/ml、TNM分期Ⅰ+Ⅱ期、高+中分化、未出现门静脉癌栓和淋巴结转移的肝癌组织SSBP1表达较低，而肿瘤大小>5 cm、AFP>200 μg/ml、TNM分期Ⅲ+Ⅳ、低分化、出现门静脉癌栓和淋巴结转移的肝癌组织SSBP1表达较高。见表5。

2.5 SSBP1表达与肝癌预后的相关性 SSBP1蛋白阳性表达患者中位生存时间为(29.78±4.05)个月，SSBP1蛋白阴性表达患者中位生存时间为(36.99±4.23)，SSBP1蛋白阳性表达患者中位生存时间显著短于SSBP1蛋白阴性表达患者，差异有统计学意义(P<0.05)。SSBP1蛋白阳性表达患者术后生存率为46.88%(30/64)，SSBP1蛋白阴性表达患者术后生存率为68.75%(11/16)，SSBP1蛋白阳性表达患者术后生存率显著低于SSBP1蛋白阴性表达患者，差异有统计学意义(P<0.05)。SSBP1蛋白阳性表达患者复发率为51.56%(33/64)，SSBP1蛋白阴性表达患者复发率为37.50%(6/16)，SSBP1蛋白阳性表达患者复发率显著高于SSBP1蛋白阴性表达患者，差异有统计学意义(P<0.05)。见表6。

表5 SSBP1表达与肝癌临床病理参数的关系

注：与对应项比较,*P<0.05

表6 SSBP1表达与肝癌预后的相关性

注：与SSBP1(-)表达比较,*P<0.05

3 讨论

肝癌是高居我国恶性肿瘤病死率第二位的常见恶性肿瘤，具有症状隐匿、进展快、病死率高的特点，其发病机制复杂，涉及多种分子和多条信号转导通路。目前，手术切除、放疗、化疗是治疗肝癌的主要手段，但这些方法远期疗效均不理想，患者5年生存率低，预后差[8]。因此，寻找有效的HCC分子标志物对于肝癌诊断和治疗具有重要临床意义。

线粒体是真核生物体内介导能量转换和新陈代谢的重要细胞器，其结构和功能的完整性对于生命活动至关重要。同时，多种核基因表达产物又能调控线粒体基因组的完整性，其中线粒体单链DNA结合蛋白(SSBP1)是调控线粒体生成和功能的关键因子。人类SSBP1基因定位于第7号染色体，其结构高度保守，包括4个外显子和3个内含子，主要参与线粒体DNA(mtDNA)的复制、转录、损伤后修复过程[9-11]。因此，SSBP1表达异常将直接导致mtDNA拷贝数异常或基因突变，最终造成恶性肿瘤的发生发展。Santos-Jr 等[12-14]发现超过70%的恶性肿瘤细胞存在SSBP1、mtDNA突变，且SSBP1活性与mtDNA拷贝数具有正相关性。SSBP1活性异常升高造成mtDNA的过度复制和大量不成熟线粒体DNA前体生成，进而导致线粒体功能障碍。已有研究证实，SSBP1表达失调与乳腺癌、大肠癌、卵巢癌、骨肉瘤等恶性肿瘤发生密切相关。Kim等[15]发现卵巢癌组织高表达SSBP1，可能与癌细胞能量代谢增高有关。Ye等[16]研究证实HCC组织SSBP1表达较癌旁组织显著升高，推测可能是由于肿瘤微环境的变化导致了SSBP1突变，且Ras-Raf-MEK-ERK通路在这一过程中发挥关键作用。但该研究并未探讨SSBP1与肝癌临床病理特征的关系。

本研究首先采用免疫组化和Real time-PCR技术检测了SSBP1 mRNA和蛋白在80例肝癌组织和癌旁组织的表达状况，结果发现SSBP1在肝癌组织的表达水平和阳性表达率显著高于癌旁组织，与鲁睿等[17]报道一致。且SSBP1在4种肝癌细胞系(HepG2、MHCC97H、SMMC7721、Huh7)的表达水平也显著高于正常人肝细胞L-02。此外，SSBP1表达与肿瘤大小、AFP、TNM分期、分化程度及有无门静脉癌栓、淋巴结转移密切相关(P<0.05)。随着肿瘤直径增大、肿瘤分期增加及恶性程度增高，SSBP1表达显著升高；此外，有门静脉癌栓和淋巴结转移的肝癌组织SSBP1表达水平和阳性表达率显著高于未出现门静脉癌栓和淋巴结转移的肝癌组织，表明SSBP1可能参与了肝癌发生及侵袭转移过程。患者术后随访6个月，我们发现SSBP1阴性表达的患者平均生存时间较SSBP1阳性表达的患者显著延长，生存率较SSBP1阳性表达的患者显著提高，复发率较SSBP1阳性的患者显著降低，说明SSBP1高表达提示预后不良。我们和他人研究结果均表明以肝癌组织异常表达的SSBP1为切入点有可能有利于揭示肝癌发病的具体分子机制，并且SSBP1可能作为潜在的肿瘤标志物，这对于肝癌诊断、疗效及预后评估具有重要临床价值[18,19]。

总之，本实验表明SSBP1基因在肝癌组织和肝癌细胞表达上调，在肝癌发生发展中发挥重要作用，且对预后评估具有一定临床价值。SSBP1可作为肝癌诊断和治疗的早期肿瘤标志物，有可能成为防治肝癌的潜在靶点。然而，由于本研究样本较少，还需扩大样本量进一步验证SSBP1在肝癌发生发展中的具体作用。此外，SSBP1介导肝癌发生发展的具体分子机制尚待后续研究。

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Expression and significance of SSBP1 in hepatocellular carcinoma tissues

MARongfen,CHENQiuying,LIUYanfen.

DepartmentofClinicalLaboratory,People’sHospitalofTangshanCity,Hebei,Tangshan063001,China

Objective To investigate the expression and significance of mitochondria single-strand DNA protein 1 (SSBP1) in hepatocellular carcinoma tissues.Methods The primary hepatocellular carcinoma tissue samples from 80 patients who were admitted and treated by surgical ablation in our hospital from December 2013 to December 2016 were collected.The expression levels of SSBP1 mRNA and protein in 80 cases of hepatocellular carcinoma tissues and cancer adjacent tissues were detected by Real time-PCR and immunohistochemistry (SP).The correlation between SSBP1 expression levels and clinicopathological parameters of hepatocellular carcinoma was analyzed.moreover the expression levels of SSBP1 in hepatocellular carcinoma cell strains including HepG2, MHCC97H, SMMC7721,Huh7 as well as normal hepatocellular line-L-027 were detected.Results The expression levels and positive expression rate of SSBP1 in cancer tissues and adjacent tissues were 1.87±0.23,0.36±0.05 and 80.00% (64/80),15.00% (12/80), respectively,and the differences were statistically significant (P<0.05).The expression levels and positive expression rate of SSBP1 in cancer tissues were obviously higher than those in cancer adjacent tissues (P<0.05).Moreover the expression levels and positive expression rate of SSBP1 in HepG2 cells were significantly higher than those in MHCC97H,SMMC7721,Huh7 and L-027 cells (P<0.05).Furthermore the expression levels of SSBP1 were closely correlated to tumor size, AFP,TNM clinical stage,differentiation degree,portal vein tumor thrombus and lymph node metastasis (P<0.05).Conclusion The overexpression of SSBP1 exists in hepatocellular carcinoma tissues and cell strains,which is related with clinicopathological parameters of hepatocellular carcinoma,moreover, the high-expression of SSBP1 is closely correlated to poor prognosis of patients.

hepatocellular carcinoma; mitochondria single-strand DNA protein 1; prognosis

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.16.006

063001 河北省唐山市人民医院检验科

R 735.7

A

1002-7386(2017)16-2428-04

2017-03-29)