利用油菜秸秆固态发酵生产β-葡萄糖苷酶的工艺优化

汪洲，肖玲玲，冯玉枚，郭金玲，田毅红，吕育财，龚大春

利用油菜秸秆固态发酵生产β-葡萄糖苷酶的工艺优化

汪洲1，肖玲玲2，冯玉枚1，郭金玲1，田毅红1，吕育财1，*龚大春1

（1.三峡大学生物催化重点实验室，湖北宜昌443002；2.湖北三峡职业技术学院，湖北宜昌443002）

通过对固态发酵条件的优化，提高黑曲霉固态发酵产β-葡萄糖苷酶的产量。首先，通过单因素试验确定麸皮与油菜秸秆粉质量比、料液比、（NH4）2SO4添加量、接种量、营养液初始pH值、培养温度、培养时间等因素对β-葡萄糖苷酶的影响，再利用三因素三水平正交试验得到最佳工艺条件。结果表明，麸皮与油菜秸秆粉质量比6∶4，料液比1∶1.8，培养温度25℃，（NH4）2SO4添加量3%，接种量5%，营养液初始pH值4.7，培养时间4 d；经优化后，固态发酵产酶平均酶活达127.4 U/g，比优化前提高了50%。

固态发酵；β-葡萄糖苷酶；油菜秸秆

0 引言

植物纤维素是地球上最丰富的可再生资源，我国每年农作物秸秆高达7×108t之多，有效利用农作物秸秆这巨大的可再生资源，将在人类的能源、粮食和环境等问题中起到重大的作用，在可持续发展战略中占有重要的地位[1]。

β-葡萄糖苷酶是纤维素酶系中一种重要的水解酶，是高效利用废弃物秸秆的关键酶之一[2]。β-葡萄糖苷酶的工业化生产目前主要有固体发酵法、深层液体发酵法。就发酵方法而言，液体深层发酵自动化程度高，容易控制，适合于大规模工业化生产[3-4]。但是，液体发酵纤维素酶的发酵培养基需要经过较为细致的加工，培养基中原料的允许浓度较低，致使产物浓度不能很高且产生大量的废水。固态发酵虽机械化程度低、产品不稳定、重复性差、但其操作工序简化、产物浓度高、节约能耗，没有大量的废水产生[5]。且固态发酵纤维素酶使用的原料不必经过复杂的加工，在发酵过程中，糖化和发酵过程同步进行，可使微生物保持自然界中的生长状态，模拟自然的生长环境[6-7]。所以，以黑曲霉固态发酵秸秆为研究对象，采用自主发明的固态发酵试验装置，在单因素试验的基础上，利用响应面对固态发酵条件进行了优化，以期得到最佳的β-葡萄糖苷酶固态发酵工艺，提供工艺的稳定性。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黑曲霉（Aspergillus niger），三峡大学生物催化宜昌市重点实验室提供；水杨素，上海源叶生物科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

BPC-250F型恒温培养箱，上海一恒科技有限公司产品；UV-1100型紫外分光光度计，上海美谱达仪器有限公司产品；XFLS-50MA型灭菌锅，浙江新丰医疗器械有限公司产品；SW-CT-1D型净化工作台，苏州净化设备有限公司产品；AR2140型分析天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司产品；FW177型中草药粉碎机。

1.2 培养基的配制

（1）种子培养基。由KH2PO40.5%，（NH4）2SO41%，MgSO4·7H2O 0.1%，葡萄糖6%配制而成。

（2）固体发酵培养基。①营养液：MgSO40.2%，（NH4）2SO42%，FeSO40.01%，KH2PO40.2%，蛋白胨0.1%，酵母膏0.1%，Co2+0.01%，羧甲基纤维素钠0.1%，吐温80 0.2%，聚乙二醇4000 1%，聚乙二醇6000 0.14%；②固体培养基：麦麸与40目油菜秸秆粉质量比6∶4。

1.3 试验方法

1.3.1 发酵方法

将活化的黑曲霉斜面种子，用无菌水冲洗，制成浓度为108个/mL的孢子悬浮液，按2%的接种量接入种子培养基，于28℃，200 r/min条件下培养48 h，然后按10%的接种量接入到固体发酵培养基上，于30℃，湿度90%条件下恒温培养44 d。

1.3.2 粗酶液的制备

将发酵所得固体酶曲按1∶10的料液比用HAc-NaAc缓冲液浸泡，搅拌10min后，再浸泡2 h，纱布过滤，以转速8 000 r/min离心，上清液即为粗酶液。

1.3.3 β-葡萄糖苷酶酶活定义及测定方法

β-葡萄糖苷酶酶活力单位的定义：在50℃，pH值4.8的条件下，每1min从质量分数为1.0%的水杨苷溶液中释放1μmoL还原糖所需的酶量为1个酶活力单位U。

β-葡萄糖苷酶酶活测定方法，采用纤维素酶制剂国家标准。

1.4 试验设计

1.4.1 发酵条件单因素试验

（1）麸皮与油菜秸秆粉质量比的确定。麸皮∶油菜秸秆粉质量比分别以1∶4，2∶3，3∶3，3∶2，4∶1，在相同条件下恒温培养4 d，测定酶活。

（2）最佳料液比的确定。分别以1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5的料液比，在相同条件下恒温培养4 d，测定酶活。

（3）最佳（NH4）2SO4添加量的确定。培养基中（NH4）2SO4添加量分别以0.5%，0.8%，1.0%，2.0%，3.0%，4.0%，5.0%，在相同条件下恒温培养4 d，测定酶活。

（4）最佳接种量的确定。分别以6%，8%，10%， 12%，14%的接种量，在相同条件下恒温培养4 d，测定酶活。

（5）营养液最适初始pH值的确定。将营养液初始pH值分别调至3，4，5，6，7，在相同条件下恒温培养4 d，测定酶活。

（6）最佳培养温度的确定。培养温度分别为25，30，35，40℃，在相同条件下恒温培养4 d，测定酶活。

（7）最佳培养时间的确定。以相同培养基和相同接种量在相同条件下分别培养4，5，6，7 d，测定酶活。

1.4.2 正交试验设计

确定β-葡萄糖苷酶主要影响因素，选取3个因素3个水平进行正交试验。

β-葡萄糖苷酶主要影响因素与水平设计见表1，正交设计见表2。

表1 β-葡萄糖苷酶主要影响因素与水平设计

表2 正交设计

通过正交试验进行方差分析，得出最优条件。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验

不同麸皮与油菜秸秆粉质量比对酶活影响见图1，不同料液比对酶活影响见图2，不同营养液初始pH值对酶活影响见图3，不同接种量对酶活影响见图4，不同（NH4）2SO4添加量对酶活影响见图5，不同培养温度对酶活影响见图6，不同培养时间对酶活影响见图7。

按照1.4的方法，利用油菜秸秆对黑曲霉固态发酵产β-葡萄糖苷酶发酵条件中的麸皮与油菜秸秆粉质量比、料液比、（NH4）2SO4添加量、接种量、营养液初始pH值、培养温度和培养时间的单因素试验优化。经分析得，麸皮与油菜秸秆粉质量比6∶4，料液比1∶2，（NH4）2SO4添加量1%，接种量8%，营养液初始pH值4.0，培养温度30℃和培养时间5 d，酶活为85 U/g。

图1 不同麸皮与油菜秸秆粉质量比对酶活影响

图2 不同料液比对酶活影响

图3 不同营养液初始pH值对酶活影响

图4 不同接种量对酶活影响

图5 不同（NH4）2SO4添加量对酶活影响

2.2 正交试验及分析

图6 不同培养温度对酶活影响

图7 不同培养时间对酶活影响

通过单因素试验分析发现，料液比、培养温度、麸皮与油菜秸秆粉质量比对β-葡萄糖苷酶酶活的影响较大，在（NH4）2SO4添加量4%，接种量8%，营养液初始pH值4.7，培养时间5 d不变的条件下，选取如表2的试验方案进行试验。

正交试验结果见表3。

表3 正交试验结果

由表3可知，麸皮与油菜秸秆粉质量比非常重要，为显著影响因素。从均值可以看出，料液比1∶1.8，培养温度25℃，麸皮与油菜秸秆粉质量比6∶4，发酵得到的β-葡萄糖苷酶酶活最高。

2.3 验证试验

通过以上试验得出的黑曲霉固态发酵生产β-葡萄糖苷酶的最佳培养条件为麸皮与油菜秸秆粉质量比6∶4，料液比1∶1.8，培养温度25℃，（NH4）2SO4

添加量3%，接种量5%，营养液初始pH值4.7，培养时间4 d。做5组平行试验，得到的酶活结果，试验值与预测值接近，表明试验设计可行。

验证试验见表4。

表4 验证试验

3 结论

在单因素所得结果的基础上，进行正交试验设计。从7个因素中筛选出3个主要影响因素，即麸皮与油菜秸秆粉质量比、料液比、培养温度。通过正交试验得出最佳培养条件为麸皮与油菜秸秆粉质量比6∶4，料液比1∶1.8，培养温度25℃，（NH4）2SO4添加量3%，接种量5%，营养液初始pH值4.7，培养时间4 d。优化后，固态发酵所产酶的平均酶活达127.4 U/g，提高了50%。由此可见，试验为油菜秸秆资源化利用提供了重要基础。

[1]孙世荣，郭祎，岳金权.我国稻草资源化利用现状及其评价[J].农业与技术，2015（17）：20-23.

[2]龚大春，冯玉枚，郭金玲，等.一种基于循环水温度控制的固态发酵装置：中国湖北，CN204676083U[P]. 2015-09-30.

[3]闫玉玲，袁敬纬，李杰，等.纤维素酶的制备工艺及其商业化现状研究[J].当代化工，2015（5）：988-990，994.

[4]赖玉城.产多酶体系混菌固态发酵酒糟生产蛋白饲料[D].福建：福建师范大学，2014.

[5]张辉，张文会，孙中强.响应面法优化黑曲霉HQ-1产β-葡萄糖苷酶的固体发酵条件[J].食品研究与开发，2012，33（11）：188-192.

[6]葛龙，赵艳，章亭洲.固态发酵技术的特点与应用[J].饲料与畜牧，2010（8）：54-56.

[7]汪彬彬，车振明.Plackett-Burman和Box-Benhnken Design实验设计法优化根霉产糖化酶发酵培养基的研究[J].食品科技，2011（5）：41-45.◇

Optimization of Process for Productionβ-glucosidase from Rape Straw

WANG Zhou1，XIAO lingling2，FENG Yumei1，GUO Jinling1，TIAN Yihong1，LV Yucai1，*GONG Dachun1
（1.Key Lab of Biocatalysis，China Three Gorges University，Yichang，Hubei443002，China；2.Hubei Three Gorges Polytechnic，Yichang，Hubei443002，China）

The production ability ofβ-glucosidase by solid state fermentation from rape straw is improved by the optimization of process.The effect of the ratio between the rape straw and bran，the ratio between the solid component and water，the temperature，the contain amountof（NH4）2SO4，the inoculum concentration，the initial pH，the fermentation time on theβ-glucosidase production is studied.The optimum conditions are obtained by the orthogonal design experiment of three factors and three levels.The results showed that the optimum conditions are the ratio 6∶4 between bran and rape straw，and the ratio 1∶1.8 between the solid and the water，the temperature 25℃，（NH4）2SO43%，the inoculum concentration 5%，the initial pH 4.7 for 4 dayswith 127.4 U/gβ-glucosidase activity，increasing 50%than before.

solid-state fementation；β-glucosidase；rape straw

S816.6

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.06.037

1671-9646（2017）06b-0026-03

2017-05-20

宜昌市科技攻关项目“纤维素糖化制备微生物柴油的工艺研究”（A15-301-b04）。

汪洲（1989—），男，在读硕士，研究方向为微生物发酵。

*通讯作者：龚大春（1967—），男，博士，教授，硕士生导师，研究方向为微生物育种、发酵及新型酶制剂。