蓝莓酒降酸酵母筛选鉴定及能力测定

李 迪，李静媛

(青岛农业大学食品科学与工程学院，山东青岛266109)

蓝莓酒降酸酵母筛选鉴定及能力测定

李 迪，李静媛

(青岛农业大学食品科学与工程学院，山东青岛266109)

蓝莓酒酸含量过高会导致酒体不协调，以蓝莓果皮表面获取的菌种作为出发菌株，经过自然筛选和紫外诱变筛选，以降酸量为依据选出降酸效果显著的菌株，并对菌株进行鉴定。结果表明，筛选出的菌株降酸量为5.2 g/L。利用WL营养琼脂培养基和分子生物学的方法，最终确定筛选菌株为酿酒酵母。该菌株能最大限度的将糖转化为酒精，转化率达91%，最终残糖为3.4 g、酒精度为7.2%vol，同时对糖、酒精也有良好的耐受性。筛选出的酿酒酵母实现了在发酵的同时进行降酸，这对于蓝莓酒业的发展来说提供了良好的酵母资源，也为微生物酿造提供了一个良好的发展方向。

微生物； 蓝莓酒； 降酸酵母； 筛选

蓝莓酒是以蓝莓浆果为原料，经自然发酵酿制而成的低度营养保健酒[1]。蓝莓酒较好地保留了浆果中天然花色苷、果胶质、维生素等营养成分[2]，具有延缓衰老、保护视力、增强人体免疫力等功能。但因酒中有机酸含量过高，酒体过于酸涩，口味粗糙，酒体不协调，破坏了酒的口感和品质，所以必须对蓝莓酒进行严格的降酸处理。目前蓝莓酒降酸的主要方法有3种，即化学降酸法[3]、物理降酸法、微生物降酸法[4]。物理、化学降酸需耗费大量能源辅料，对酒负面影响较大且降酸具有选择性。与之相比，微生物降酸具有明显优势，降酸的同时，增加酒的稳定性，提升酒风味复杂性和口感[3]。

微生物降酸的一种途径是利用乳酸菌在苹果酸-乳酸发酵（malolactic fermentation，MLF）中将苹果酸降解为乳酸，迄今为止，国外生产的优质红葡萄酒甚至一些佐餐红葡萄酒大部分都采用MLF降酸，但这个过程一般发生在酒精发酵之后，耗时长且不易控制[5]；另一种途径是利用酵母进行降酸，较典型的有利用粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）在苹果酸-酒精发酵(Malo-alcoholic Fermentation,MAF)中将苹果酸分解为乙醇和CO2，从而降低酒的酸度[6-9]，该方法能较好保持酒的清爽感与口感[10]，实现发酵的同时降酸。但裂殖酵母发酵能力较弱，会产生不良气味。

利用酵母进行果酒降酸是一个较新的研究方向，目前，筛选应用于蓝莓酒降酸的酵母研究较少。本研究拟以蓝莓果皮表面的菌种为出发菌株，经自然筛选和紫外诱变筛选出降酸及发酵能力强的酵母并对其发酵特性进行探索，以应用到蓝莓酒发酵中，以期实现在发酵同时进行降酸处理。试验所筛出的菌种可以作为新菌种进行生产，在一定程度上丰富了果酒生物降酸的内涵，为提高蓝莓酒的口感品质奠定了基础，具有广阔的应用前景。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蓝莓：市售；蓝莓的糖含量是138 g/L，酸含量是9.146 mg/g。

商业酵母(Saccharomyces cerevisiae）AWRI R2：拉曼公司。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast peptone dextrose YPDfgreg)培养基：酵母膏1%、蛋白胨2%、葡萄糖2%、琼脂粉2%。

模拟蓝莓汁培养基：葡萄糖13%、磷酸二氢钾0.5%、硫酸铵0.2%、七水硫酸镁0.04%、酵母膏0.1%、草酸0.197 g/L、酒石酸0.333 g/L、苹果酸1.170 g/L、柠檬酸7.446 g/L。

WL琼脂培养基：酵母膏0.4%、胰蛋白胨0.5%、葡萄糖5%、磷酸二氢钾0.055%、氯化钾0.0425%、氯化钙0.0125%、硫酸镁0.0125%、氯化铁0.00025%、硫酸锰0.00025%、琼脂2%、溴甲酚绿0.0022%。

1.2 仪器与设备

YXQ-LS-50S11立式压力蒸汽灭菌器，上海博迅医疗器械有限公司；KDM电子调温电热套（1000 mL），山东华鲁电热仪器有限公司；H13221台式酸度测定仪，北京慧龙环科环境仪器有有限公司；SPX-250BS-II生化培养箱，宁波东南仪器有限公司；HYQ-180s摇床，武汉汇诚生物科技有限公司；BSC-1100ⅡA2生物安全柜，北京东联哈尔仪器制造有限公司；酒精计，陆恒生物科技有限公司；电子天平，美国Ohaus公司。

1.3 试验方法

1.3.1 菌液制备

称取2 g蓝莓样品于2个250 mL三角瓶中，加几粒玻璃珠，并加入100 mL无菌生理盐水，室温下以100 r/min摇床振荡20 min后，取出静置20 min。量取上清液5 mL，加入到100 mL YPD液体培养基中，以25℃、100 r/min摇床振荡培养24 h。以同样的条件再转接培养1次，获得菌液。

1.3.2 菌种分离

将菌液按照 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6梯度稀释。将稀释菌液均匀涂布于YPD固体培养基上，25℃恒温培养3～4 d，获得单菌落。

1.3.3 菌种的自然筛选

将分离所得的100株单菌落分别接种到100 mL模拟蓝莓汁培养基中，于25℃、100 r/min摇床中培养4 d。用浓度为0.5 mol/L的氢氧化钠标准溶液滴定菌液，据降酸量初步获得2株降酸能力较好的菌株，斜面4℃保存。

1.3.4 菌种的紫外诱变

（1）分别取初筛所得2株菌转入YPD培养基，进行菌种活化。分别吸取酵母菌悬液5 mL于平板上，打开20 W紫外灯，距离20 cm，分别照射0 min、1 min、2 min、3 min、4 min、5 min。

（2）将诱变后的菌液加入到2倍体积的新鲜YPD培养基中，避光放置在28℃培养箱中，2 h后取出。

（3）将未照射的对照菌液和经紫外灯照射的菌液稀释涂布在YPD固体培养基上，并用黑布包裹，28℃恒温培养48 h。

（4）挑取长出的40个菌落转接到YPD液体培养基中24 h，进行菌种活化。

（5）按1%接种量将活化的酵母菌液接种到模拟蓝莓汁培养基中，以28℃、100 r/min摇床培养4 d后，用浓度为0.5 mol/L的氢氧化钠标准溶液滴定酵母菌液和空白培养基，选出1株降酸量最大的菌株，斜面4℃保存。

1.3.5 菌种鉴定

将获得的酵母菌株，在YPD培养基活化后涂布到WL营养培养基上，28℃培养5 d后观察，根据菌落颜色及形态与蓝莓酒相关酵母类别鉴别表（表1）进行对比，初步确定菌种种类[11]。

挑取筛选菌株中具有典型形态的菌株，送中科院微生物研究所进行分子生物学鉴定。

1.3.6 筛选菌株发酵性能分析

（1）发酵速率测定：将分筛选出的菌株以及1株商业酵母分别活化接入到模拟蓝莓汁培养基中，每间隔24 h称1次培养瓶的重量，发酵温度为25℃，每次与前一次的差值即为CO2的质量损失[12]。

（2）OD600nm值的测定：将筛选得到的菌株以及1株商业酵母分别活化接种到模拟蓝莓汁培养基中，每隔2 h进行取样，测其OD600nm，至稳定末期，绘制曲线。

（3）酵母发酵产物的测定：发酵结束后，对发酵液的残糖和酒精含量进行测定，判断该菌株对糖的转化能力及转化效率。

1.3.7 筛选菌株耐受性分析

（1）酒精耐受性：将模拟蓝莓汁培养基的酒精度调整为12%vol，接入已活化的酵母菌，在28℃下静置培养，每隔3 h测其OD600nm，记录数据，绘制生长曲线。

（2）糖耐受性的测定：将模拟蓝莓汁培养基的糖浓度调整为20%，接入已活化的酵母菌，接种量为1×106cfu/mL，在28℃条件下静置培养，每隔3 h振荡测OD600nm，记录数据，绘制生长曲线。

1.3.8 指标的测定

（1）总酸滴定

参考GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》。

（2）酒精度测量

参考GB 5009.225—2016《食品安全国家标准酒中乙醇浓度（酒精度）的测定》。

（3）降酸能力测定

以降酸量衡量降酸能力，公式如下：

式中：X—样品的降酸量，g/L；C—氢氧化钠标准溶液的物质的量浓度，mol/L；V0—空白培养基消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；V1—样品滴定时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；V2—吸取样品的体积，mL；S1—0.075。

2 结果与分析

2.1 菌种的筛选

挑取100株分离获得的菌株进行降酸量计算，得到的降酸范围在0.2～3.7 g/L之间，选取降酸效果明显的20株绘制出图1，由图1可看出，菌种9号和13号的降酸量分别为3.7 g/L、3.4 g/L，降酸效果最好，因此选取菌种9号及13号进行紫外诱变。

挑取40株紫外诱变后分离获得的菌株进行降酸量计算，得到的降酸范围在3.8～5.2 g/L，选出10株降酸好的菌，绘制降酸量见图2。从图2可以看出，诱变后的菌株之间降酸效果差别不大，但相比自然筛出的菌株降酸能力显著提高。选6号为最终的菌株，进行菌种鉴定。

表1 WL营养培养基对蓝莓酒相关酵母的鉴别

图1 酵母菌降酸量

图2 酵母菌降酸量

2.2 菌种鉴定

筛选出的6号酵母菌在WL营养培养基上生长的菌落颜色为奶油色至绿色，表面为球形突起，光滑，不透明，奶油状的菌株，菌株形态见图3，与表1对比，初步确定为酿酒酵母。

图3 筛选菌株在培养基上的菌落形态

对分离菌株的rDNA ITS区进行克隆和测序，碱基序列如下：

TTTCCGTAGGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT AAAGAAATTTAATAATTTTGAAAATGGATTTTT TTTTGTTTTGGCAAGAGCATGAGAGCTTTTACT GGGCAAGAAGACAAGAGATGGAGAGTCCAGC CGGGCCTGCGCTTAAGTGCGCGGTCTTGCTAG GCCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACG GTGAGAGATTTCTGTGCTTTTGTTATAGGACAA TTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAG TTTTCATATCTTTGCAACTTTTTCTTTGGGCATT CGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAACAAACAC AAACAATTTTATCTATTCATTAAATTTTTGTCAA AAACAAGAATTTTCGTAACTGGAAATTTTAAA ATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGT TCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCG ATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATC ATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGG TATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATT TCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGTGAGTGA TACTCTTTGGAGTTAACTTGAAATTGCTGGCCT TTTCATTGGATGTTTTTTTTTCCAAAGAGAGGT TTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTACG GTCGTTTTAGGTTTTACCAACTGCGGCTAATCT TTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTATCGATA AGAAGAGAGCGTCTAGGCGAACAATGTTCTTAAAGTTTGACCTCA

与Saccharomyces cerevisiea模式菌株S288C的rDNA ITS区序列(GenBank accession number:Z73329)进行对照和比较，分析结果显示，分离菌株ITS区碱基序列与Saccharomyces cerevisiea模式菌株的相应碱基序列相似率为99.5%，分离的酵母菌株可确定为酿酒酵母。

2.3 酵母发酵性能测定

2.3.1 酵母发酵速率测定

比较筛选酵母与商业酵母的发酵性能，结果见图4。由图4可以看出，筛选酵母的CO2产生速率及产生量与商业酵母相比，基本一致，具有良好的发酵性能。

图4 不同酵母菌发酵速率的比较

2.3.2 OD600nm值的测定

将筛选所得的酵母和商业酵母进行生长特性的比较，结果见图5。由图5可看出，筛选酵母和商业酵母比较，生长曲线相似，筛选酵母的迟滞期与商业酵母相比没有明显的区别，对数期生长较快，细胞分裂快，具备良好的发酵生长特性。

图5 酵母生长性能比较分析

2.3.3 酵母发酵产物测定

发酵结束后，对发酵液中的残糖含量及乙醇含量进行测量，测得发酵液的残糖量为3.4 g＜4.0 g，说明菌能够充分利用培养基的糖，有良好发酵糖的能力。酒精度为7.2%vol，达到期望的酒精度数，说明该菌具有较高的转化率。

2.4 酵母耐受性评定

2.4.1 酒精耐受性

酒精对细胞的抑制作用比较复杂，重点体现在它能够抑制酵母菌的存活、增殖速度和发酵力3个方面。本实验比较了筛选酵母和商业酵母在外加酒精培养基中生长的差异来考察酵母菌的酒精耐受性，生长曲线见图6。由图6可知，筛选酵母和商业酵母相似，在酒精度为12%vol时生长情况正常，说明筛选出的酵母具有良好的酒精耐受性。

图6 初始酒精度12%vol YPD培养基中的生长曲线

2.4.2 糖耐受性的测定

在葡萄酒工业中，糖是酒精发酵的基质，也是酵母赖以生存的能源物质，含糖量为20%及以上时，酵母菌的生长发酵就会受到抑制，结果见图7。由图7可看出，在葡萄糖浓度为20%的培养基中筛选酵母的生长曲线与商业酵母相似，说明筛选的酵母菌具有良好的糖耐受性。

图7 初始糖浓度为20%YPD培养基中酵母生长曲线

3 结果与讨论

本研究通过自然筛选和紫外诱变从蓝莓果皮上筛出的酵母降酸效果良好，降酸量达5.2 g/L，同时对糖的发酵及酒精的转化率也较高，酒精转化率达91%。与常规的苹果酸-乳酸发酵相比，在不影响基本工艺的要求下，一定程度上弥补了耗时长及不易控制等缺点，实现了发酵的同时降酸，简化了工艺，具有较大优势。

本研究采用紫外诱变的方式筛出降酸显著的菌株，这可能是由于紫外处理造成酿酒酵母的基因突变，从而实现降酸能力的提高。纵观近几年众多学者、专家的研究，其改造手段主要是利用基因工程技术和原生质体融合技术对降酸酵母进行基因改造。人们设想，把乳酸菌中的MLF基因通过遗传转化导入葡萄酒酵母中，使葡萄酒酵母在酒精发酵的同时，赋予其MLF降酸的功能[13]。目前，已对MLF基因及其调节基因进行了定位和序列分析，转基因方法已用于葡萄酒酵母工程菌的育种[14]。但对于进行基因改造的酵母，仍面临着许多问题，如基因是否表达以及是否完全表达及其安全性、菌株的遗传稳定性等问题[15]，这对于之后的研究及大规模工业化生产来说，仍需要更深入的研究和探索。

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Screening of an Acid-Reducing Yeast Strain for Blueberry Wine Production and Determination of Its Properties

LI Di and LI Jingyuan
(College of Food Science and Engineering,Qingdao Agricultural University,Qingdao,Shandong 266109,China)

Excessive acid in blueberry wine will damage the harmony of wine body.In this study,yeast strains obtained from the skin of blueberry were used as the starting strains.After natural selection and UV mutagenesis screening,a yeast strain with good performance in deacidification was selected,and the strain was identified.The results showed that,the deacidification amount of the strain was 5.2 g/L.The strain was identified as S.cerevisiae based on WL culture medium and molecular biology.Such strain could convert sugar into alcohol thoroughly and the conversion rate reached up to 91%.After the fermentation,the residual sugar content was 3.4 g and the content of alcohol was 7.2%vol.Besides,the strain had good tolerance for high sugar and high alcohol.The screened strain could achieve fermentation and deacidification simultaneously and it was a good choice for the production of blueberry wine.

microbe;blueberry wine;acid-reducing yeast;screening

TS262.7；TS261.4；TS261.1

A

1001-9286（2017）07-0046-06

10.13746/j.njkj2017082

国家自然基金青年基金（31501458）；青岛农业大学高层次人才科研基金（6631113350）。

2017-04-07；

2017-06-21

李迪（1995-），女，本科，研究方向为葡萄酒酿造；E-mail：lidi17854266337@163.com。

李静媛（1985-），女，博士研究生，讲师，研究方向为葡萄酒酿造；E-mail：jyli@qau.edu.cn。

优先数字出版时间：2017-05-04；地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170504.0841.001.html。