液相色谱-串联质谱结合谱库检索法同时测定饲料中4种黄曲霉毒素

杨琳芬，符金华，姜文娟，邢磊，尹腾桂，董泽民，赵薇娜，樊晶，金海红

（江西省兽药饲料监察所，江西南昌330096）

液相色谱-串联质谱结合谱库检索法同时测定饲料中4种黄曲霉毒素

杨琳芬，符金华*，姜文娟，邢磊，尹腾桂，董泽民，赵薇娜，樊晶，金海红

（江西省兽药饲料监察所，江西南昌330096）

本文建立了饲料中4种黄曲霉毒素（黄曲霉毒素AFB1、黄曲霉毒素AFB2、黄曲霉毒素AFG1、黄曲霉毒素AFG2）多残留的液相色谱-三重四级杆/线性离子阱串联质谱（Qtrap-LC-MS/MS）的检测方法。样品前处理简单高效，经过80%的乙腈水萃取后，再经过SPE小柱净化。结果表明：在浓度0.5～50 ng/mL时线性良好，相关系数均大于0.995；添加浓度为1.0～20 ng/mL时，回收率为72.5%～95.7%。在市场上购买了8种品牌饲料，实验结果显示黄曲霉毒素AFB1污染较为严重。该方法采用MRM定量的同时结合了谱库检索进一步定性，实现了同时定性和定量检测分析，对于常规实验室准确定量检测有着重要参考意义。

黄曲霉毒素；液相色谱；质谱；EPI谱库

霉菌毒素，又称真菌毒素，是产毒真菌在一定环境条件下产生的次级代谢产物。在所有霉菌毒素中，黄曲霉毒素的毒性、致癌性、污染频率均居高首位，是毒性最强的天然物质。可引起人类和动物急性或慢性中毒，部分已证实具有致癌、致畸、致细胞突变的“三致”作用（朱聪英等，2010；杨静等，2009）。黄曲霉毒素对饲料质量有严重的影响，会导致动物中毒、白细胞缺乏症等，还会引起肾中毒、肝中毒、生殖异常以及抑制免疫反应，给畜牧业发展和畜产品安全造成极大的危害。因此，我国对饲料中各种黄曲霉毒素的限量有着严格要求（GB 2761-2011），最低限量已达0.5 μg/kg。

目前有关毒素的检测方法有酶联免疫法（ELISA）、薄层色谱法（TLC）、液相色谱法（HPLC）、气相色谱串联质谱（GC-MS）等（朱聪英等，2010；杨静等，2009；魏丽莉，2008；Chiar等，2005；鲍蕾等，2005），这些方法在一定程度上解决了黄曲霉毒素的检测方法问题，但是存在诸多问题，其中免疫学法通常作为筛选方法，不能准确定量，容易出现假阳性；液相色谱法容易受到基质干扰，且检测限很难达到限量标准的要求；气相色谱串联质谱法往往需要衍生化等步骤，操作繁琐。以上方法无法对样品进行准确定性和定量，因此不能作为最终的确证方法。高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）是一种集高效分离和多组分定性、定量于一体的系统，对沸点高、不易挥发和热不稳定化合物的分离和鉴定具有独特优势，成为近年来分析化学中发展非常快的新技术之一（Markus等，2012；Johannes等，2012；Mira等，2010）。并且该方法检测时无需衍生化，操作简单、省时，能够在保证灵敏度的情况下仍可以达到在目标范围内未知化合物筛选的目的。该方法已成为近年来分析检测黄曲霉毒素的主要方法，并且已经应用到黄曲霉毒素的污染检测当中（Micheal等，2009）。

然而，随着HPLC-MS/MS应用的不断深入和成熟，发现该技术在分析检测复杂基质样品中的化合物时，除了具有较强抗基体干扰能力、高通量、高选择性、高灵敏度的同时，也逐步发现该技术的一些不足之处。譬如：由于基质的复杂性，会影响目标物的离子比例发生较大变化，从而导致测量结果为假阴性（Trufelli等，2011）。本实验采用高效液相色谱-串联四级杆/线性离子阱质谱方法，该方法具有从多级反应检测（MRM）-信息依赖性采集（IDA）-增强子离子扫描（EPI）-谱库检索的独有检测模式，该模式原理为：当MRM信号超过设定的阈值（根据IDA进行设置）时，MRM与EPI会交替进行扫描。因此，既可以得到MRM的谱图，也可以得到EPI二级质谱的全部碎片信息，即该化合物的指纹图谱，进一步谱库检索达到同时定性和定量的目的。目前，国内外单独建立黄曲霉毒素的LC-MS/MS谱的较少，本文以4种黄曲霉毒素为例，建立了4种黄曲霉毒素的LC-MS/MS谱库，并且利用谱库检索建立了快速定性和定量分析4种黄曲霉毒素的液相色谱-三重四级杆/线性离子阱串联质谱（Qtrap-LC-MS/MS）的检测方法。该方法在准确定量和定性分析饲料中黄曲霉毒素和保证饲料安全品质方面具有重要的参考意义。

1 实验材料与方法

1.1 仪器和试剂质谱型号为Sciex4500 Qtrap（美国Sciex公司）；液相为岛津LC-20AD XR（日本Shimadzu公司）；3k30离心机（德国Sigma公司）；MS 3D S25微量振荡器（德国IKA公司）；NEVAPTM111氮吹仪（美国Organomation Associates Inc公司）；固相萃取装置（SPE，美国Supelco公司）；METTLER TOLEDO XP 205天平；

标准溶液：分别精密称取5.0 mg黄曲霉毒素AFB1、AFB2、AFG1、AFG2对照品，置于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释定容，即为50 mg/mL的标准品储备液，置于-18℃冰箱中保存。分别吸取0.2 mL上述标准品储备液于10 mL的棕色容量瓶中，用甲醇稀释到刻度，即为1.0 mg/mL的混合标准工作溶液，冷藏保存。

1.2 实验方法液相色谱法：色谱柱为Kinetex C18，2.6 μm，2.1×100 mm（品牌为phenomenex）；流速0.3 mL/min；进样体积1 μL；流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为乙腈；洗脱程序见表1。

表1 洗脱梯度

质谱条件：多级反应检测（MRM）扫描，ESI离子源；气帘气30 psi；雾化气55 psi；辅助雾化器55 psi；温度550℃；喷雾电压5500 V；气体均为氮气；MRM离子对见表2；当MRM响应值大于200 cps时同时启动线性离子阱的EPI功能。EPI扫描范围：50～350 Da；扫描速度10000 Da/s；动态填充时间小于5 ms。

1.3 样品前处理称取（5±0.1）g饲料样品于50 mL离心管中，准确加入10 mL 80%的乙腈水溶液，涡旋2 min，剧烈震荡10 min，离心取上清液，重复提取一次合并上清液；在合并提取液中加入10 mL正己烷涡旋1 min，待静止分层，去掉上清液，重复去脂一次；然后蒸干，用5 mL水复溶待净化；复溶液用SPE小柱净化，控制流速2 mL/min左右，抽干，搜集流出液，在60℃下氮气吹干，用1 mL 0.1%的甲酸水（10%的甲醇）复溶，涡旋5 s，过0.22 μm滤膜上机测试。

表2 MRM离子对列表（1是定量离子）

1.4 LC-MS/MS谱库的建立实验分别采用低、中、高3种不同能量（20、35、50 eV）和扩展能量CES（35±15）对4种黄曲霉毒素进行EPI扫描，并且用Access编写4种黄曲霉毒素LC-MS/MS数据库。

2 结果与讨论

2.1 方法的检出限、回收率、重复性以及线性范围将4种黄曲霉毒素混合标准工作溶液用空白基质依次稀释成0.5～50 ng/mL的系列浓度进行测定。将测得的各种毒素的峰面积的平均值Y与所对应的浓度X（ng/mL）做回归曲线，求得线性回归方程和相关系数（r），外标法定量。结果表明，4种毒素在浓度0.5～50 ng/mL有着良好的线性关系，相关系数均大于0.995；在1.0、5.0、10.0、20.0 ng/mL（n=3）4个不同浓度添加水平下做了回收率实验，回收率分别是72.5%、80.6%、88.9%、95.7%，相对标准偏差（RSD%）均小于5.9%；4种毒素的检出限（信噪比大于3）和定量限（信噪比大于10）结果见表3。

表3 方法的检出限、回收率、重复性以及线性范围

2.2 质谱分析检测实验采用蠕动泵注射50 ng/mL的4种毒素混标溶液，在正离子模式做一级母离子扫描，得到4种化合物的准分子离子峰[M+H]+，然后采用子离子扫描得到化合物的子离子，在MRM模式下优化化合物去簇电压（DP）和碰撞能量（CE），优化结果见表2。为了达到同时定性和定量的目的，本实验采用了MRM-IDA-EPI-谱库检索智能化的多步模式。首先结合Qtrap的线性离子阱功能，从MRM模式（图1）获得化合物的保留时间、峰面积、离子比率等信息，在通过EPI扫描获得二级质谱图，利用已经建立好的谱库进行检索。这种模式对化合物结构的确认有很大帮助。

图1 四种黄曲霉毒素在混标浓度为2 ng/mL的色谱图

采用该方法对实际阳性可疑样品进行检测，获得其MRM图，然后采用EPI图进行谱库检索。其中Fit值（匹配度）是用标准物质EPI与可疑样品谱图进行比较后得到的匹配度，满分为100分，Fit值越大说明该化合物的可能性越大；RevFit值（反相匹配度）是用可疑样品谱图与标准品的EPI图进行对比后获得的匹配度；Purity值（纯度值）是综合前两种的结果得出的数值，所有的匹配结果可以进行排序。从图1可知该化合物是黄曲霉毒素B1（AFB1）。

2.3 实际样品检测采用建立好的方法进行样品分析检测，在市场上随机购买8种不同品牌的饲料进行测定，结果发现，样品普遍存在黄曲霉毒素的污染，尤其是黄曲霉毒素B1污染较为严重，结果见表4。实验结果表明，该方法能满足我国对饲料中黄曲霉毒素污染进行监控的需要。

表48 种饲料样品中黄曲霉毒素的含量（N/A表示未检出）μg/kg

3 结论

本文建立了饲料中4种黄曲霉素毒素的高效液相色谱-三重四级杆/离子阱质谱的分析方法，结合自建的4种黄曲霉毒素LC-MS/MS标准谱库，采用MRM-IDA-EPI-谱库检索的多步模式，成功实现了4种毒素的快速定性和定量分析。该方法前处理简单、快速、回收率高、准确度高、方法稳定性好，可满足对饲料中黄曲霉毒素的残留检测分析要求。

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[2]魏丽莉.黄曲霉毒素对食品的污染及防治措施[J].粮油加工，2008，9：86～89. [3]杨静，哈益明，王峰，等.高效液相色谱法-串联质谱法检测花生中的黄曲霉毒素B1[J].分析实验室，2009，28（6）：35～38.

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[7]Johannes M W O，Ido P K，Chromatogr B J.883-884，2012，18.

[8]Markus H，Chromatogr J.B.2012，3：883～884.

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[11]Trufelli H，Palma P，Famiglini G，et al.Spectrom.Rev.30，2011，491.■

In this paper，we established 4 kinds of Aspergillus flavus toxin in the feed（Aspergillus flavus toxin AFB1，aflatoxin AFB2，Aspergillus flavus toxin AFG1，Aspergillus flavus toxin AFG2）multi residue liquid phase chromatography triple four rod/linear ion trap tandem detecting method of mass spectrometry（Qtrap-LC-MS/MS）.The samples pretreatment was simple and efficient.The samples were extracted by 80%acetonitrile water and purified by SPE column.The results showed that in the concentration of 0.5～50 ng/mL linear good，the correlation coefficient was greater than 0.995；the concentration of 1～20 ng/mL，the recovery rate of 72.5%～95.7%.In the market to buy 8 kinds of brand feed，the experimental results show that aflatoxin B1pollution was more serious.The method adopts MRM quantitative analysis and combines with the further qualitative analysis of the spectral library search.It can realize both qualitative and quantitative analysis.It has important reference value for the accurate and quantitative detection of the conventional laboratory.

aflatoxin；liquid chromatography；mass spectrometry；EPI library

S816.17

A

1004-3314（2017）14-0028-03

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20171407

*通讯作者