胃癌细胞促进网膜脂肪干细胞分化的机制研究*

张倩 彭开文 吴晗 龚俊 姬忠贺② 李雁②

·基础研究·

胃癌细胞促进网膜脂肪干细胞分化的机制研究*

张倩①彭开文①吴晗①龚俊①姬忠贺①②李雁①②

目的：本实验主要研究在胃癌条件培养基（conditioned medium，CM）诱导下网膜脂肪干细胞（omental-adipose stromal cells，O-ASCs）是否能分化为癌相关成纤维细胞（carcinoma-associated fibroblasts，CAFs），及ERK信号通路在其中的作用。方法：通过诱导分化成骨、成脂及流式细胞鉴定O-ASCs，将O-ASCs与MGC803和SGC7901 CM共培养，通过RT-PCR和Western-blot检测O-ASCs细胞CAFs标志物α-SMA、FSP-1、vimentin，旁分泌因子VEGFA、TGFβ-1、FAP、SDF-1的表达水平。将O-ASCs分为对照组，SGC7901-CM实验组，SGC7901-CM+U0126处理组，12 h后收集细胞。Western blot检测O-ASCs细胞CAFs标志物α-SMA、FSP-1及ERK1/2、p-ERK1/2的表达水平。结果：经鉴定原代培养出的细胞为O-ASCs，在SGC7901 CM和MGC803 CM作用下，CAFs标志物α-SMA、FSP-1、vimentin及旁分泌因子SDF-1、VEGFA、TGFβ-1、FAP表达均有明显增加（P＜0.05）。与对照组比较SGC7901-CM组α-SMA、FSP-1、p-ERK1/2表达明显增加（P＜0.05），ERK表达未见明显变化（P＞0.05）。SGC7901-CM+U0126组与SGC7901-CM组比较，α-SMA、FSP-1及p-ERK1/2的蛋白表达水平明显降低（P＜0.05），ERK表达变化无统计学意义（P＞0.05）。结论：O-ASCs通过分化为CAFs及旁分泌作用参与胃癌腹膜转移，ERK信号通路在该过程中发挥了重要作用。

胃癌 癌相关成纤维细胞 网膜脂肪干细胞 ERK信号通路 腹膜转移

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，2015年中国因胃癌死亡人数达到498/10万，居癌症死因第2位［1］。导致胃癌患者死亡的主要因素是全身或局部区域转移和/或复发，有文献报道15%～50%胃癌患者术中探查时即发现腹膜转移［2］。手术治疗对该疾病效果差，中位生存期约6个月［3］。

脂肪干细胞（adipose-derived stem cells，ASCs）是一类存在于脂肪组织中，具有显著可塑性和多向分化潜能的成体干细胞［4］。脂肪干细胞对肿瘤生物学行为的影响具有复杂的特性［5-6］，在肿瘤的发生发展中起到重要作用，是肿瘤微环境中重要的成体干细胞。但是目前脂肪干细胞对肿瘤影响的机制尚不明确。部分观点认为脂肪干细胞通过分化为癌相关成纤维细胞（carcinoma-associated fibroblasts，CAFs）或肌成纤维细胞（myofibroblast），而对肿瘤生长和转移起促进作用［4］；另一部分观点认为脂肪干细胞对肿瘤的趋化作用及旁分泌作用是其发挥作用的关键因素［7］。

由于大网膜是胃癌腹膜转移主要部位之一，而大网膜含有丰富的脂肪组织和网膜脂肪干细胞（omental-adipose stromal cells，O-ASCs），因此研究O-ASCs在胃癌腹膜转移中的机制和作用具有重要意义。本实验通过体外培养O-ASCs，讨论O-ASCs能否在胃癌条件培养基（conditioned medium，CM）诱导下分化为CAFs，并讨论ERK信号通路在其中的作用，有望找到胃癌腹膜转移的新靶点，为其治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 实验所用脂肪组织均取自武汉大学中南医院肿瘤科10例手术患者，BMI≤25，大网膜均无肿瘤转移。MGC803与SGC7901胃癌细胞均为武汉大学中南医院科研中心的储备细胞。

1.1.2 主要试剂及仪器 胎牛血清（ScienCell，美国）；I型胶原酶（购自美国Worthington公司）；OriC⁃ellTM成人脂肪间质干细胞成骨及成脂诱导分化培养基试剂盒（购自广东Cyagen公司）；U0126（Selleck⁃men，美国）；兔抗人单克隆抗体GAPDH、FSP-1、α-SMA、VEGFA、TGFβ1、ERK、p-ERK1/2（购自美国Ab⁃cam公司）；辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗（购自武汉博士德公司）。荧光定量PCR仪、垂直电泳槽（购自美国Bio-Rad公司）。本实验经武汉大学中南医院伦理委员会批准，并与患者签署相关知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 原代培养O-ASCs 手术室中无菌条件下取脂肪组织，加入4℃预冷磷酸盐缓冲液（PBS）中（青霉素100 mU/L，链霉素100 ng/L），迅速带回实验室超净台内进行操作。PBS反复冲洗，剪去肉眼可见的血管及结缔组织，剪成1 mm×1 mm×1 mm的小块，加入等体积的0.1%Ⅰ型胶原酶，37℃消化1 h后，2000 r·min-1离心10 min，弃上清后加入3 mL红细胞裂解液吹打3～5 min，1500 r·min-1离心5 min弃上清后在培养基（低糖DMEM、10%胎牛血清、1%青链霉素）中重悬细胞，按5×104个细胞/cm2接种至100 mm培养皿中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。

1.2.2 对O-ASCs成骨及成脂诱导 将第2代OASCs按2×104个细胞/cm2接种于6孔板中，加入成骨及成脂诱导培养基，诱导21 d后，中性甲醛固定细胞，分别用茜素红及油红O染液染色后观察。

1.2.3 流式细胞检测 将第3代O-ASCs胰酶消化，用PBS清洗2次后，分别孵育PE-CD29、PECy7-CD34（购自美国BD公司）、PE-CD45、FITC-CD90、PE-CD106（购自美国eBioscience公司）等荧光标记的鼠抗人流式抗体30 min，PBS反复清洗后重悬，采用NovoCyteTM系列流式细胞仪检测细胞表面标志物的表达。

1.2.4 绘制O-ASCs生长曲线 按CCK-8 Kit试剂盒（购自安徽Biosharp公司）说明书制作标准曲线，取第2代对数期脂肪干细胞消化并计数，按5×103个细胞/孔接种于96孔板中，贴壁培养3 h后每孔加入10 μL CCK-8溶液反应1 h，使用酶标仪（购自美国Bio-Rad公司）450 nm波长下测第一组OD值，标记为0 d。以后每天相同条件下分别测得1 d～6 d的OD值，根据标准曲线绘制脂肪干细胞生长曲线。

1.2.5 胃癌条件培养基的制备 分别取冻存的MGC803和SGC7901胃癌细胞复苏。当细胞融合度处于60%～70%时，换上新鲜培养基，37℃5%CO2培养箱中过夜。第二天回收培养皿中的培养基，2 000 r·min-1离心10 min，取上清液0.22 μm滤器过滤，视其为MGC803和SGC7901 CM，于4℃保存并用于后续实验。

1.2.6RT-PCR检测O-ASCs中相关mRNA表达水平 将第3代O-ASCs按2×104个细胞/cm2接种于6孔板中，将O-ASCs分为MGC803-CM实验组、SGC7901-CM实验组、对照组。37℃、5%CO2培养箱中培养12 h后，用RIPA细胞裂解液裂解以备后用。分别用Trizol（购自安徽Biosharp公司）提取各实验组样本总RNA，紫外分光光度计和电泳检测RNA浓度、纯度和完整性。通过逆转录试剂盒获取cDNA，通过SYBR®Premix Ex TaqTMII（购自日本Takara公司）获得不同样本中目的基因的相对表达量。实验重复3次以上。通过2-△△Ct法计算目的基因相对内参GAPDH基因的表达差异。引物序列见表1。

1.2.7 Western blot检测O-ASCs中相关蛋白表达水平 取上一步实验中RIPA裂解后细胞，分别检测α-SMA、FSP-1、VEGFA、TGFβ-1蛋白表达。同时将OASCs分为对照组、SGC7901-CM实验组、SGC7901-CM+U0126处理组。U0126使用时须在培养体系中加入20 μmo/L预处理0.5 h，以阻断ERK信号通路。将各组细胞37℃、5%CO2培养箱中培养。12 h后RI⁃PA裂解液裂解细胞，分别检测α-SMA、FSP-1及ERK、p-ERK1/2的蛋白表达。以GAPDH作为内参校正并作相对量分析。实验重复3次。

1.3 统计学处理

采用SPSS 21.0及Graph Pad Prism 5.0软件进行统计学分析，实验数据以±s表示。组间的比较采用t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 O-ASCs培养及鉴定

原代培养的细胞12 h开始贴壁，初期细胞体积小，成纺锤形或梭形。48 h贴壁细胞增加，以梭形为主。72 h梭形细胞开始大量增殖，局部呈旋涡状或平行紧密排列。以后每3 d换液，细胞达到75%～90%融合后传代（图1A）。

O-ASCs成骨诱导分化21 d后可见茜素红染色阳性的钙沉积颗粒（图1B），成脂诱导分化21 d后可见油红O染色阳性的脂肪样细胞（图1C）。流式细胞检测表达CD29、CD90阳性细胞＞98%，表达CD34、CD45、CD106阳性细胞＜2%（图1D）。经鉴定所获得的细胞为O-ASCs。

2.2 O-ASCs生长曲线

用CCK-8 Kit检测第3代O-ASCs生长增殖能力，细胞生长曲线呈S形（图2），增殖潜伏期约为1 d，第2 d开始进入指数增长期，增殖迅速，第5 d生长速度减慢、进入生长平台期，至第8 d细胞呈长梭形，漩涡状生长融合至90%以上。

2.3 O-ASCs在MGC803和SGC7901CM作用下向CAFs分化

O-ASCs分别与MGC803和SGC7901 CM共培养12 h后检测a-SMA、FSP-1及vimentin的mRNA及蛋白表达水平变化。与对照组相比，CM诱导后CAFs标志物 α-SMA、FSP-1、vimentin均有明显增加（P＜0.05），提示O-ASCs向CAFs分化（图3）。

图1 O-ASCs的培养及鉴定Figure 1 Culture and identification of O-ASCs

图2 第三代O-ASCs生长曲线Figure 2 Growth curve of passage 3 O-ASCs

2.4 O-ASCs在CM作用下相关旁分泌因子增加

与对照组相比，O-ASCs与MGC803和SGC7901 CM共培养12 h后SDF-1、VEGFA、TGFβ-1、FAP均明显增加（P＜0.05，图4）。

2.5 O-ASCs在U0126作用后向CAFs分化受抑制

与对照组相比，SGC7901-CM实验组CAFs特异性标志物α-SMA、FSP-1及ERK信号通路蛋白p-ERK1/2均明显增加（P＜0.05），ERK表达未见明显变化（P＞0.05）。 SGC7901-CM+U0126处 理 组 与SGC7901-CM实验组比较，α-SMA、FSP-1及p-ERK1/2的蛋白表达水平明显降低（P＜0.05），ERK表达变化无统计学意义（P＞0.05，图5）。

图3 胃癌CM促进O-ASCs分化为CAFsFigure 3 Gastric cancer CM-induced differentiation of O-ASCs towards CAFs

图4 胃癌CM促进O-ASCs相关旁分泌因子增加Figure 4 Gastric cancer CM promoted the expression of paracrine factors

图5 O-ASCs在U0126作用后向CAFs分化受抑制Figure 5 O-ASC differentiation towards CAFs inhibited by U0126

3 讨论

研究证明O-ASCs与妇科恶性肿瘤（如卵巢癌、子宫内膜癌等）的腹腔种植转移相关［8-10］，通过分化为 CAFs［4］和/或旁分泌［7］提高癌细胞的侵袭、转移能力。CAFs是一类同时具有肌细胞和成纤维细胞特点的成纤维细胞亚型，参与肿瘤的增殖、细胞外基质重塑和炎症反应，其特征是高表达α-SMA、FSP-1、vi⁃mentin［11-12］。本研究证实O-ASCs分别暴露于两种不同胃癌细胞系（SGC7901，MGC803）来源CM中，可具有分化成CAFs的能力，其CAFs标志物α-SMA、FSP-1、vimentin表达均明显升高（P＜0.05）。

在胃癌CM作用下，O-ASCs除了分化为CAFs，其旁分泌因子SDF-1、VEGFA、TGFβ-1、FAP表达均显著增加（P＜0.05）。SDF-1/CXCR4轴在调节胃癌细胞生长、侵袭和转移能力时起重要作用［7］。VEGF调节组织低氧微环境，在促进肿瘤血管形成中起重要作用［13］。TGFβ 1-Smad信号通路是上皮性恶性肿瘤上皮间质转化的经典途径［14］。Cohen等［15］证实FAP提高肿瘤患者的淋巴结转移率、术后复发率及死亡率。因此在胃癌CM作用下O-ASCs可通过多方面的机制促进肿瘤的生长、血管生成、侵袭和转移。Cho等［16］证实人ASCs在乳腺癌外泌体作用下可分化为CAFs，且其Smad2及ERK磷酸化作用增强。而Cho等［17］发现ERK磷酸化与ASCs的增殖及活性密切相关。本研究推测胃癌细胞通过ERK信号通路促进O-ASCs向CAFs分化。为研究ERK信号通路作用机制，本研究采用了特异性ERK信号通路抑制剂U0126，选择性抑制ERK1/2磷酸化过程，从而抑制其生物学作用。与对照组比较，SGC7901-CM组α-SMA、FSP-1及p-ERK1/2均明显增加（P＜0.05），提示ERK信号通路可能参与O-ASCs分化过程。与SGC7901-CM组比较，SGC7901-CM+CMU0126组α-SMA、FSP-1及p-ERK1/2含量明显降低（P＜0.05），提示ERK1/2磷酸化过程被抑制后，O-ASCs向CAFs分化能力明显减弱。研究结果提示ERK信号通路参与O-ASCs向CAFs分化过程。

本研究明确了胃癌细胞CM具有诱导O-ASCs向CAFs分化，促进其旁分泌因子表达等作用。同时证明了O-ASCs通过该过程参与胃癌腹膜转移，且ERK信号通路在该过程中发挥了重要作用。

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（

2017-01-09收稿）

（2017-06-13修回）

（编辑：武斌 校对：杨红欣）

Mechanisms of differentiation of omental-adipose stromal cells promoted by gastric cancer cells

Qian ZHANG1,Kaiwen PENG1,Han WU1,Jun GONG1,Zhonghe JI1,2,Yan LI1,2

Yan LI;E-mail:liyansd 2@163.com

Objective:To investigate whether the omental-adipose stromal cells(O-ASCs)exposing to gastric cancer-conditioned medium(CM)could be inducted to differentiate into carcinoma-associated fibroblasts(CAFs)and the effect of ERK signaling pathway in the process.Methods:We identified O-ASCs by examining their ability to differentiate osteogenic and adipogenic lineages and through flow cytometry.O-ASCs were co-cultured with MGC803 and SGC7901CM.The expression of CAFs markers(α-SMA,FSP-1,and vimentin)and paracrine factors(VEGFA,TGF-β1,FAP,and SDF-1)were evaluated by RT-PCR and Western blot.In vitro cultures of OASCs were divided into three groups:the control,SGC7901-CM,and SGC7901-CM+U0126 groups.Cells were collected after 12 h.Western blot was performed to evaluate the expression of α-SMA,FSP-1,ERK,and p-ERK1/2.Results:The primary cells were O-ASCs.The expression levels of CAFs markers(α-SMA,FSP-1,and vimentin)and O-ASC paracrine factors(VEGFA,TGF-β1,FAP,and SDF-1)clearly increased(P＜0.05).In comparison with the control,the expression of ERK in SGC7901-CM group did not change(P＞0.05),while the expression of p-ERK1/2,α-SMA,and FSP-1 significantly improved(P＜0.05).Comparison of SGC 7901-CM+U0126 and SGC 7901-CM groups showed that the expression levels of ERK had no statistical difference(P＞0.05),while the expression levels of p-ERK1/2,α-SMA,and FSP-1 decreased(P＜0.05).Conclusion:O-ASCs participate in the peritoneal metastasis of gastric cancer through differentiation by CAF and paracrine factors.The ERK signaling pathway is important in the differentiation of O-ASCs towards CAFs.

gastric cancer,carcinoma-associated fibroblasts,omental-adipose stromal cells,ERK signaling pathway,peritoneal metastasis

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.13.025

①武汉大学中南医院肿瘤科，肿瘤生物学行为湖北省重点实验室，湖北省肿瘤医学临床研究中心（武汉市430071）；②首都医科大学附属北京世纪坛医院肿瘤中心腹膜肿瘤外科

*本文课题受2013年湖北省医学领军人才培养工程项目（编号：鄂卫生计生发［2013］4号），教育部博士点基金（编号：20120141110042）资助

李雁 liyansd2@163.com

1Department of Oncology,Zhongnan Hospital of Wuhan University,Hubei Key Laboratory of Tumor Biological Behaviors and Hubei Cancer Clinical Study Center,Wuhan 430071,China;2Department of Peritoneal Cancer Surgery,Beijing Shijitan Hospital,Capital Medical University,Beijing 100038,China

This work was supported by Hubei Province Outstanding Medical Academic Leader Program,and the Science Fund for Doctorate Mentors by China's Ministry of Education(No.20120141110042)

张倩 专业方向为肿瘤生物学研究。

E-mail：1014557276@qq.com