鱼肽的制备及其对盐胁迫下3种蔬菜种子萌发的影响

2017-07-29刘金龙辛寒晓范学明刘丽英孙中涛

山东农业科学 2017年7期

刘金龙+辛寒晓+范学明+刘丽英+孙中涛

摘要：采用复合酶法水解低值鱼下脚料制备鱼肽，并探讨鱼肽对盐胁迫下辣椒、番茄和茄子种子萌发的影响。结果表明，中性蛋白酶和风味蛋白酶对低值鱼下脚料具有较强的水解能力，二者以1∶3的比例对低值鱼下脚料水解时，最佳水解条件为加酶量3.7%（E/S）、pH值6.8、酶解温度52℃。在此条件下，酶解360 min，水解度可达41.41%，此时鱼肽的得率为78.73%，纯度为76.82%。在盐胁迫下，以0.1%～0.7% 的鱼肽溶液对辣椒、番茄和茄子进行浸种处理，其发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数均有不同程度提高，且均以0.5%的鱼肽溶液处理效果最佳。说明适宜浓度的鱼肽用于蔬菜浸种，能够有效减轻盐胁迫对种子的伤害。

关键词：鱼肽；盐胁迫；蔬菜种子；发芽特性

中图分类号：S641.01 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2017）07-0059-07

Abstract The fish peptide was produced through hydrolyzing low-value fish wastes using multi-enzyme method. And the effects of fish peptide on seed germination of pepper， tomato and brinjaul under salt stress were explored. The results showed that neutral protease and flavourzyme had stronger hydrolyzing ability on fish wastes. When neutral protease and flavourzyme were adopted together at the ratio of 1∶3， the optimal technology conditions were multi-enzyme of 3.7% （E/S）， pH value of 6.8 and temperature of 52℃. Under these conditions， after hydrolyzing for 360 minutes， the hydrolyzing degree reached 41.41%， the fish peptide yield was 78.73% with the purity of 76.82%. When three kinds of vegetable seeds were soaked with 0.1%～0.7% fish peptide， the germination rate， germination energy， germination index and vigor index showed rising trends in varying degrees under salt stress. Among which， the remission effects of 0.5% fish peptide were the best. These results indicated that pretreating vegetable seeds with the suitable concentration of fish peptide could effectively ease the damage caused by salt stress.

Keywords Fish peptide； Salt stress； Vegetable seed； Germination trait

近年来，随着水产加工业的迅猛发展，带鱼、小黄鱼等低值鱼下脚料的产量日益增加。低值鱼下脚料蛋白质含量较高，价格低廉，是一类优质的蛋白资源。目前，低值鱼下脚料除部分用于生产生物饲料与复合调味料外[1，2]，大部分未能进行综合利用，被当作废弃物处理[3]。采用蛋白酶对低值鱼下脚料进行水解，生产鱼肽，可以提高低值鱼下脚料的综合利用水平[4，5]。大量研究证实，多肽作为五大植物激素以外的又一类新型植物生长调节物质，在促进植物生长[6]、提高作物产量和改善果实品质[7]、增强作物抗逆性[8]等方面发挥着重要作用。因此，酶法水解低值鱼下脚料制备鱼肽，并将其应用于农业生产具有重要意义。

据统计，我国盐碱地面积近3 600万公顷，约占总耕地面积的10%[9]。除此之外，由于近年来大量施用化学肥料，土壤理化性状及生物学特性都发生了很大變化，致使土壤次生盐渍化问题突出，在蔬菜育苗时常出现萌发时间延迟、缺苗断垄、生长不整齐等现象[10]。盐胁迫已成为我国农业健康发展的限制性因素之一，如何减轻盐害对植物生长的抑制已成为国内外研究的热点。研究发现，种子在萌发阶段对盐胁迫十分敏感[11]，施用大豆肽等肽类物质可有效减轻盐分对作物生长的胁迫效应[12]，但有关鱼肽对盐胁迫下蔬菜种子萌发的研究鲜见报道。

外源多肽的生物活性与其分子量大小有关，优化酶解工艺，提高蛋白质的水解度，降低肽的分子量，不仅可以提高肽的得率，还可提高其应用效果[13-16]。因此，本研究优化复合酶法水解带鱼、小黄鱼等低值鱼下脚料制备鱼肽的生产工艺，并探讨其对盐胁迫下辣椒、番茄和茄子种子萌发的影响，以期为盐渍地推广应用鱼肽提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

低值鱼下脚料系小黄鱼深加工副产品，蛋白质含量14.82%，购自泰安农贸市场；辣椒（特大羊角椒）、番茄（中蔬四号）、茄子（早熟京茄一号）种子购自泰安市泰山区农大种业；酸性蛋白酶（1.6×105 U/g）和风味蛋白酶（Flavourzyme 500 MG）制剂购于诺维信（中国）投资有限公司；菠萝蛋白酶（0.8×105 U/g）、木瓜蛋白酶（2×105 U/g）和中性蛋白酶（2×105 U/g）制剂购于南宁庞博生物工程有限公司；胰蛋白酶（2×105 U/g）购于南京奥多福尼生物科技有限公司；D-果糖购于Solarbio公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 蛋白酶种类的筛选

参考陈季旺等[17]的方法并改进：精确称取10 g低值鱼下脚料（脱脂），置于250 mL 具塞三角瓶中，加入50 mL蒸馏水，混匀，分别添加3%（E/S，以底物重量计）的酸性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、菠萝蛋白酶、风味蛋白酶，并调至各酶的最适pH值，在50℃恒温振荡器中酶解240 min，然后95℃水浴灭酶10 min，冷却至室温，抽滤，计算酶解液水解度（degree of hydrolysis，DH），筛选出适宜的蛋白酶。

1.3 复合酶配比筛选

将10 g低值鱼下腳料与50 mL蒸馏水置于250 mL具塞三角瓶中，添加3%（E/S，以底物重量计）的复合酶，混匀。复合酶由两种水解效果最佳的蛋白酶以不同的比例复配而成，其配比分别为1∶1、1∶2、1∶3、2∶1、3∶1。在50℃恒温振荡器中酶解240 min，水解完成后，于95℃灭酶10 min，冷却至室温，抽滤，计算DH，以确定最佳配比。

1.4 加酶量、温度、pH值、时间等酶解条件的单因素试验

分别控制不同的加酶量（1%～5%）、温度（40～60℃）、pH值（5.0～8.5）和酶解时间（60～600 min），按1.3步骤进行单因素试验，测定上清液的DH。

1.5 Box-Behnken试验

在单因素试验基础上，仅考虑对水解度影响显著的因素，设计Box-Behnken试验，试验因素与水平见表1。

1.6 种子萌发试验

根据前期3种蔬菜种子耐盐性预试验的结果，本研究在中度（100 mmol/L NaCl）盐胁迫下进行种子萌发试验。将辣椒、番茄和茄子等种子用5%的次氯酸钠处理10 min，用蒸馏水冲洗干净，自然晾干，分别用不同浓度的鱼肽溶液和去离子水浸种处理。试验共设6个处理，如表2所示。浸种24 h后，以蒸馏水清洗种子，并将其置于铺有2层滤纸的培养皿（直径为12 cm）内，分别加入100 mmol/L NaCl溶液10 mL，对照组加入等量去离子水。番茄和茄子种子置于（25±1）℃避光培养，辣椒种子置于（28±1）℃避光培养。每处理重复4次，每皿60粒种子。萌发期间定时定量补充NaCl溶液或去离子水保持滤纸湿润。番茄萌发到第4 d时测定种子发芽势，第7 d时统计种子的发芽率、发芽指数和活力指数；辣椒和茄子萌发到第7 d时分别测定种子发芽势，第14 d时统计种子的发芽率、发芽指数和活力指数。

1.7 测定项目与方法

1.7.1 鱼肽常规指标的测定参照王国强等[18]的方法，采用凯氏定氮法测定可溶性氮含量；采用双缩脲法测定肽含量；采用索氏提取法测定脂肪含量；采用105℃恒重法测定水分含量；采用550℃灼烧法测定灰分含量。参照张雪等[19]的方法，采用重量法计算酶解后鱼肽得率。

1.7.2 水解度的测定参照马艳芳等[20]的方法测定，水解度（%）=水解后生成的α-氨基态氮含量/样品总氮含量×100；茚三酮法测定α-氨基态氮含量；凯氏定氮法测定样品总氮含量。

1.7.3 种子萌发指标的测定参照赵艳艳等[21]的方法测定，发芽势（GE，%）=规定天数内发芽种子数/T×100；发芽率（GR，%）=试验结束后的发芽种子数/T×100；发芽指数（GI）=∑（Gt/Dt）；活力指数（VI）=GI×S。式中Gt表示在t时间内发芽数；Dt表示相应的发芽天数，T表示供试种子总数，S为幼苗平均鲜重。

1.8 数据处理

试验数据采用Design-Expert 8.0.6和SPSS 19.0等软件进行分析处理，采用Origin 8.5软件作图。

2 结果与分析

2.1 蛋白酶种类对鱼蛋白水解度的影响

由图1可知，中性蛋白酶水解度最大，达到28.87%；风味蛋白酶水解度次之，达到26.85%。6种蛋白酶对鱼蛋白的水解能力从强到弱依次为：中性蛋白酶>风味蛋白酶>木瓜蛋白酶>胰蛋白酶>菠萝蛋白酶>酸性蛋白酶。从水解效果考虑，选取中性蛋白酶与风味蛋白酶组成复合酶较为适宜。

2.2 复合酶配比及其添加量对鱼蛋白水解度的影响

由图2a可知，鱼蛋白水解度随着中性蛋白酶与风味蛋白酶配比的不同而不同，当中性蛋白酶∶风味蛋白酶=1∶3时，水解度最大，达到34.16%，比中性蛋白酶和风味蛋白酶的单酶水解度分别提高了18.32%、27.23%，为最佳复合酶配比。

复合酶（中性蛋白酶与风味蛋白酶）添加量在1%～3%范围内，鱼蛋白水解度随加酶量的增加而增大，3%时达到最大，为35.18%（图2b）；之后水解度基本不变，这可能是因为酶与底物的结合基本处于饱和状态。因此复合酶的最适添加量为3%。

2.3 温度与pH值对鱼蛋白水解度的影响

如图3a所示，40～50℃时，鱼蛋白水解度随着温度的升高而增大；50～60℃时，蛋白酶活性因酶解温度升高受到抑制，水解度降低。50℃时水解度最大，达到36.01%，为复合酶的最适酶解温度。

如图3b所示，鱼蛋白的水解度随pH值的增加呈先升高后降低趋势，pH值6.5时水解度最大，达到38.13%，为最适pH值。

2.4 酶解时间对鱼蛋白水解度的影响

如图4所示，酶解60～360 min内，随着酶解时间的延长，鱼蛋白的水解度呈上升趋势，360 min时最大，达到40.39%；继续延长酶解时间，水解度基本不变。为节约成本和时间，宜选取360 min为最佳酶解时间。

2.5 Box-Behnken试验结果与分析

在单因素试验的基础上利用Design-Expert 8.0.6 软件对试验数据进行响应面分析（见表3）。根据水解度（Y）对加酶量（X1）、温度（X2）和pH值（X3）3个因素的影响建立回归方程Y=41.05+0.60X1+2.23X2+0.89X3+0.16X1X2+0.48X1X3-0.045X2X3-0.71X12-2.54X22-0.97X32。

由表4可以看出，此模型的P<0.0001，达到极显著水平，失拟项的P=0.3287>0.05，拟合度较好。模型相关系数R2=0.9820，表明响应值的变化有98.20%来源于所选变量，说明该模型很好地反映了加酶量、温度、pH值等因素对水解度的影响，能够准确描述与预测鱼蛋白的酶解过程。从模型系数的显著性检验结果可以看出，模型的自变量一次项X1、X2、X3和二次项X22、X32对水解度的影响均达极显著水平（P<0.01）；二次项X12影响显著（P<0.05），其余各项对水解度的影响不显著（P>0.05）。利用Design-Expert 8.0.6软件绘制加酶量、温度与pH值3个因素对鱼蛋白水解度的响应面图（图5）。模型预测的3个因素的值分别为：加酶量3.69%、温度52.27℃、pH值6.81，在此条件下，预测的水解度最大值为42.05%。在验证试验中，考虑到实际操作方便，将酶解工艺参数调整为：加酶量3.7%，温度52℃，pH值6.8，以此工艺条件平行试验3次，水解度的实际值为41.41%±0.42%。此时鱼肽的得率为78.73%。

2.6 鱼肽成分的测定

鱼肽成分的测定结果表明，其可溶性氮含量85.34%，肽含量76.82%，水分含量4.17%，脂肪含量0.31%，灰分含量6.31%。可见采用该酶解法水解低值鱼下脚料中的鱼蛋白，肽含量较高，能够有效提高原料中多肽的转化率，该方法可行。

2.7 鱼肽对盐胁迫下蔬菜种子萌发的影响

由表5可知，与CK相比，在盐胁迫下（T1～T5），辣椒、番茄和茄子种子的发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数均显著降低，表明盐胁迫明显抑制了3种蔬菜种子的萌发。与T1相比，采用0.1%～0.7%鱼肽溶液对3种蔬菜种子进行浸种处理，其发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数均有不同程度提高，且均以0.5%鱼肽溶液处理的效果最佳，均显著高于T1，增幅分别为23.05%、52.17%、42.89%、72.31%（辣椒），41.65%、59.23%、70.60%、77.78%（番茄），54.06%、54.99%、75.17%、81.82%（茄子）。

3 讨论与结论

本研究选用中性蛋白酶与风味蛋白酶协同方式水解低值鱼下脚料，通过单因素试验和响应面法确定鱼肽的最佳工艺参数为：中性蛋白酶与风味蛋白酶配比为1∶3、加酶量3.7%（E/S）、酶解温度52℃、pH值6.8，在此条件下酶解360 min，水解度可达41.41%，此时鱼肽的得率为78.73%，纯度为76.82%。

种子萌发是植物发育的起点，也是衡量作物耐盐性强弱的关键时期。盐胁迫直接影响种子的萌发，是制约蔬菜产业发展的关键因素之一。发芽率、发芽势、发芽指数及活力指数能潜在地反映种子萌发速率、发芽整齐度和出苗健壮等特点，是衡量种子萌发、植物生长的重要依据[22]。本研究结果表明，在100 mmol/L NaCl胁迫下，辣椒、番茄和茄子种子的发芽率、发芽势、发芽指数及活力指数显著低于对照，即种子的萌发明显受到抑制，这与赵艳艳[21]、吴雪霞[22]和闫芳[23]等的研究结果一致，表明种子在萌发阶段对盐胁迫敏感。有研究表明，多肽是一类新型植物生长调节物质，在增强植物抗逆胁迫方面发挥着重要作用[8，12，24]。本研究采用0.1%～0.7%的鱼肽溶液对3种蔬菜种子浸种处理，其发芽率、发芽势、发芽指数及活力指数均有不同程度提高，其中用0.5%鱼肽溶液处理的效果最佳，3种蔬菜种子的发芽率、发芽势、发芽指数及活力指数显著提高，表明适宜浓度的鱼肽能够有效减轻盐胁迫对辣椒、番茄和茄子种子萌发造成的伤害。这与宋丽华[25]和马光恕[26]等的研究结果相似，说明鱼肽在种子萌发、抗逆等方面发挥着重要作用。本试验初步研究了鱼肽对盐胁迫下蔬菜种子萌发的影响，而对于蔬菜幼苗抗盐性的作用机制，后续试验将进一步深入研究。

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