慢病毒靶向携带Akt1 shRNA对胃癌细胞SGC—7901凋亡和增殖的影响

谭韡++于红刚++罗和生++周巍

[摘要] 目的 探讨慢病毒载体靶向携带Akt1基因短发夹RNA（Akt1-shRNA）对胃癌细胞SGC-7901凋亡和增殖的影响。 方法 构建表达Akt1-shRNA的慢病毒载体，转染293T细胞后获得Akt1-shRNA的慢病毒颗粒，病毒感染胃癌SGC-7901细胞（SGC-LV-shAkt1）为实验组细胞，SGC7901细胞和转染慢病毒空载体SGC7901细胞（SGC-LV-shCON）为对照组细胞。Real-Time PCR检测Akt1 mRNA表达水平，Western blot检测胃癌细胞Akt1、phospho-Akt（ser473）和bcl-2蛋白表达水平，然后流式双染法、生长速率等方法检测Akt1 shRNA对SGC-7901细胞凋亡及增殖能力的影响。 结果 成功构建Akt1基因RNAi的慢病毒载体LV-shAkt1，病毒滴度为5×108 TU/mL。SGC-7901细胞转染后，实验组（SGC-LV-shAkt1）Akt1 mRNA 和Akt1、p-Akt、bcl-2蛋白表达水平较对照组（SGC-7901、SGC-LV-shCON）降低（P < 0.01）；（38.7±3.5）%的实验组细胞凋亡（P < 0.05）。SGC-LV-shAkt1细胞生长曲线平缓，生长速度较另两种细胞（SGC-7901、SGC- LV-shCON）明显降低。 结论 靶向Akt1的RNAi 能有效抑制胃癌细胞SGC-7901的生长，诱导胃癌细胞凋亡，其机制可能与抑制PI3K/Akt信号通路，下调抗凋亡蛋白bcl-2有关。

[关键词] Akt1；慢病毒载体；胃癌；凋亡

[中图分类号] R735.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）06（b）-0023-05

Department of Gastroenterology， Renmin Hospital of Wuhan University Hubei Key Laboratory of Digestive System Disease， Hubei Province， Wuhan 430060， China

[Abstract] Objective To investigate the apoptosis and proliferation effect of lentiviral vectors shRNA for Akt1 to human gastric carcinoma SGC-7901 cells. Methods The lentiviral vectors Akt1-shRNA were constructed， lentivirus Akt1-shRNA was transfected into human gastric carcinoma SGC-7901 cells， the SGC-7901 cell strained with Akt1 gene silencing perpetually （SGC-LV-shCON） was as conrol group cell and amplified （SGC LV-shAkt1） was as experiment group cell. Effect of Akt1 on SGC-7901 cells were measured by RT-PCR， Western-blot， flow cytometry of annexin V-FITC/PI， tumor growth curve. Results Akt1 RNAi lentiviral vectors LV-shAkt1 was established successfully， virus titer was 5×108 TU/mL. After SGC-7901 cell transfection， the expression of Akt1 mRNA in experiment group （SGC- LV-shAkt1） was weaker than that in the control group （SGC-7901， SGC- LV-shCON）， and Akt1， p-Akt and bcl-2 protein expressions in experiment group was inhabited （P < 0.01）， （38.7±3.5）% cell in experiment group happened apotosis （P < 0.05）. The cell growth curve of SGC-LV-shAkt1 cell was gentle， compared with SGC-7901 cell or SGC- LV-shCON cell， the growth was lower. Conclusion The lentiviral vectors mediated shRNA for Akt1 can significantly inhibit the expression of Akt1 gene in vitro and markedly inhibit SGC-7901 cell growth and induce the apoptosis of gastric carcinoma cell.The mechanism may be down-regulation of PI3K/Akt signal pathway and anti-apoptosis protein bcl-2 expression.

[Key words] Akt1； Lentiviral vector； Gastric carcinoma； Apotosis

Akt，又稱蛋白激酶B （protein kinase B，PKB） ，是1种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。目前发现至少存在3种Akt家族成员：Aktl/PKBα、Akt2/PKBβ、Akt3/PKBγ[1]。许多文献报道，Akt与肿瘤的发生、发展关系密切[2-3]。慢病毒载体靶向介导的RNA干扰（RNA interference，RNAi）是一种高效的基因沉默技术，能特异性阻断哺乳动物细胞中靶基因的表达[4]。本研究通过构建Akt1靶向短发夹RNA（shRNA）真核表达载体，阻断胃癌细胞Akt1的表达，观察转染后胃癌细胞增殖和凋亡的变化，为其在临床上的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人胃癌细胞SGC-7901购自中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库。转染试剂Lipofectamine 2000，Trizol试剂和兔抗人Akt1、phospho-Akt（ser473）购自Invitrogen公司。鼠抗人bcl-2抗体购自Sigma公司、actin抗体和ECL发光剂购自美国Santa Cruz公司。RT-PCR试剂盒来自TOYOBO公司，引物由上海Invitrogen公司设计合成。Annexin V-FITC/PI双染试剂盒及磷酸化蛋白提取试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。

慢病毒载体系统：慢病毒载体系统由pGCL-GFP 载体、pHelper1.0（gag/pol 元件）载体、Helper2.0（VSVG 元件）载体3种质粒组成，其中pGCSIL-GFP 载体含有能持续表达shRNA 的元件，同时能表达绿色荧光蛋白GFP；pHelper1.0 和pHelper2.0含有病毒包装所必须的元件（上海吉凯基因化学技术公司）。

1.2 方法

1.2.1 人胃癌细胞培养 细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，培养条件为37℃、5%CO2，常规培养，细胞为单层贴壁生长，待贴壁细胞融合达70%～80%时以胰酶消化传代。

1.2.2 慢病毒靶向Akt1 shRNA表达载体构建 根据短发夹RNA设计原则和Genebank中报道的Akt1核苷酸序列（N0.NM005163），设计合成3对针对Akt1基因siRNA的寡核苷酸序列，经分别构建质粒，转染293T细胞（慢病毒的包装细胞），据其对Akt1的抑制率，确定有效的靶序列：5'-GGCCAAGTCCTTGCTTTCA-3'。据此设计出针对靶序列的两条互补DNA序列，具体序列如下：5'-CCGGGAGGCCAAGTCCTTGCTTTC？鄄ATTCAAGAGATGAAAGCAAGGACTTGGCCTCTTTTT？鄄G-3'；5'-AATTCAAAAAGAGGCCAAGTCCTTGCTTT？鄄CATCTCTTGAATGAAAGCAAGGACTTGGCCTC-3'，上述每条链序列即为21 nt有效靶序列，插入pGCSIL-GFP再同步合成另一长21 nt与人类基因组无关碱基序列，并插入相同载体作为阴性对照。将其转化DH5α大肠埃希菌，挑取重组阳性克隆进行PCR 及测序鉴定。PCR鉴定阳性克隆的上游引物序列为：5'-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3'，下游引物：5'-GTA？鄄ATACGGTTATCCACGCG-3'。合成成功的以上重组载体与pHelper1.0载体、pHelper2.0载体包装质粒共转染293T细胞，收集转染后48 h的293T细胞培养上清液体，经浓缩获得有活性的慢病毒颗粒载体（Akt1-RNAi-LV、NC-LV），过滤浓缩、测定病毒滴度，测得病毒滴度为5×108 TU/mL，并获得SGC-7901的MOI值（SGC-7901 MOI值是10）后-80℃保存。

1.2.3 载体病毒感染人胃癌细胞 收集SGC-7901细胞，制备成单细胞悬液，计数，接种至24孔板中。根据病毒滴度和SGC-7901的MOI值取对照慢病毒（NC-LV）和干扰慢病毒（Akt1-RNAi-LV）载体，感染靶细胞。感染12 h后，去除含病毒载体的培养液，洗涤后，加入新鲜含血清RPMI 1640继续培养48 h，观察细胞绿色荧光产生，获得成功转染Akt1-RNAi-LV和NC-LV的胃癌细胞，分别命名为SGC-LV-shAkt1（S-LV-A）和SGC-LV-shCON（S-LV-C）细胞，供进一步实验。

1.2.4 Real-Time PCR 检测转染前后Akt1 mRNA的表达：用0.25%胰蛋白酶消化并收集培养S-LV-A、S-LV-C和SGC-7901细胞，制成细胞悬液并计算细胞数，每个样本收集等量细胞（3.0×106），用Trizol法提取上述3种细胞的总RNA。然后用RT-PCR 试剂盒鉴定转染Akt1 的细胞克隆是否低表达。Akt1上游引物5'-GAGCGGGAGGAGTGGACAA-3'；下游引物5'-GGGACAGGTGGAAGAACAGC-3'，actin上游引物5'-CGAGCGGGAAATCGTG-CGT-GACATTAAGGAGA-3'，下游引物5'-CGTCATCTCCTGCTTGCTGATCCACA？鄄TCTG-3'。actin作為内参照。PCR反应条件为：94℃4 min变性，循环条件为94℃ 30 s，57.7℃（Akt1）40 s（β-actin 62.3℃），72 ℃ 40 s ，30次循环，72℃延伸5 min。7500 Real-Time PCR System仪器反应，反应结束后，由7500 Real-Time PCR软件自动记录荧光曲线并分析计算出Ct值。建立actin作为内对照，检测被测样品RNA的完整性和可靠性。结果的计算：ΔΔCt=（样品Ct均值-内参照Ct均值）-（对照样品Ct均值-对照内参照Ct均值），然后取2-ΔΔCt即代表被检样品初始Akt1 mRNA的含量。

1.2.5 Western blot印迹检测Akt1、p-Akt和bcl-2蛋白表达 用0.25%胰蛋白酶消化S-LV-A、S-LV-C和SGC-7901细胞，制成细胞悬液并计算细胞数，每个样本收集等量细胞（5.0×106），加入细胞裂解液，提取蛋白质，以10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，然后将蛋白电泳转移到硝酸纤维素膜（NC）上，硝酸纤维膜加入10 %脱脂奶粉封闭2 h后，加入一抗工作液（兔抗人Akt1、p-Akt、bcl-2、β-actin单克隆抗体，工作浓度为1∶1000；兔抗人bcl-2单克隆抗体，工作浓度为1∶400），4℃过夜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶3000稀释）孵育1 h，应用增强的化学发光法显影，暗室曝光于X线胶片上，定影显影，以actin作为内参照。

1.2.6 流式双染法检测上述三种细胞凋亡情况 按试剂盒说明书进行操作，分别取S-LV-A、S-LV-C和SGC-7901细胞，0.25%胰酶消化，收集1×107个细胞，冷PBS缓冲液洗2次，重悬于1×结合缓冲液，调整细胞密度为1×107/mL。取100 μL细胞悬液至流式专用试管中，再加400 μL 1×结合缓冲液，再依次加入5 μL AnnexinV-F ITC标记液和10 μL PI标记液，混匀，室温避光孵育15 min后，上流式细胞仪检测，用MULTICYLE 110 DNA专用分析软件分析获得数据。

1.2.7 生长速率检测 上述3种细胞经0.25%胰蛋白酶消化成单细胞悬液后，接种于6孔板，每种细胞接种7孔，每孔1×104个细胞，每日取1孔细胞进行计数，绘制细胞生长曲线。

1.2.8 细胞克隆实验检测细胞的增殖能力 上述3种细胞经0.25%胰蛋白酶消化成单细胞悬液后，调整细胞密度为5×103/mL，接种至6孔板，10 d后，弃去培养液，固定、染色拍照，倒置显微镜下计数，大于50个细胞集落为1个克隆，根据公式计算克隆形成率：克隆形成率（%）=克隆数/5000×100%

1.3 统计学方法

采用统计软件SPSS 16.0对数据进行分析，正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 慢病毒靶向携带Akt1 shRNA在SGC-7901细胞转染效率的测定

荧光显微镜下观察SGC-7901细胞转染慢病毒载体情况：转染后先在白光下观察细胞形态，了解细胞数目。再在同一视野下选用蓝光观察转染细胞内绿色荧光蛋白的情况以评估转染效率。成功转染慢病毒靶向携带Akt1 shRNA的SGC-7901细胞可表达绿色荧光蛋白，在病毒（MOI=10）转染48 h后，慢病毒靶向携带Akt1 shRNA的转染效率可达到90%以上。见图1。

2.2 Real-Time PCR 检测Akt1 mRNA 表达水平

实验组（S-LV-A细胞）和对照组（S-LV-C和SGC-7901细胞）三种细胞中Akt1 mRNA的相对表达定量分别是（20.33±3.2）%、（45.97±3.7）%、（49.77±4.1）%，实验组与对照组比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。对照组内差异无统计学意义（P > 0.05）。见图2。

2.3 Akt1基因沉默后对SGC-7901生长和凋亡的影响

2.3.1 Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡 实验组的凋亡率达到（38.7±3.5）%，而对照组的两种细胞凋亡率低（1.3±0.8）%、（2.1±0.6）%，实验组与对照组比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见图3。

2.3.2 Akt1基因沉默后对SGC-7901细胞生长速率的影响 三组细胞的生长曲线详见图4。实验组细胞生长曲线较为平缓，生长速度较对照组两种细胞降低。三组细胞接种6孔板10 d后，计算克隆形成率。结果表明：实验组比对照组两种细胞的克隆形成能力明显降低，根据公式计算克隆形成率分别为5.5%、27.1%和26.4%，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图 5。

2.4 Western blot印迹检测Akt1、p-Akt和bcl-2蛋白表达水平

三组细胞（SGC-7901、S-LV-C和S-LV-A细胞）Akt1、phospho-Akt（p-Akt）和bcl-2蛋白表达水平在对照组（SGC-7901和S-LV-C细胞）中差异无统计学意义（P > 0.05），而在实验组（S-LV-A细胞）中表达水平明显低于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图6。

3 讨论

胃癌是常见的恶性肿瘤，位于全球癌症相关死亡原因的第2位[5]，胃癌的发生发展与细胞内信号通路的异常活化有关。在许多细胞内信号通路中PI3K/Akt信号传导通路的激活已被认为是肿瘤细胞抗凋亡的主要机制之一[6]。PI3K主要是通过其3位羟基磷酸化产物PIP3转移蛋白激酶B（Akt）到细胞膜上，并改变Akt的构象使之能被3′-磷脂酰肌醇依赖蛋白激酶1/2（PDK1/2）所磷酸化（p-Akt）和激活，从而传递抗凋亡和增殖信号[7]。因此，可以通过抑制Akt基因表达达到抑制肿瘤生长的目的[8]。

Akt，又称蛋白激酶B[9]，该激酶蛋白由3个高度保守区组成：末端pleckstrin同源区（PH），中央激酶催化区（CAT）和包含一个疏水调节结构的C末端扩展区（EXT）。Akt主要有三种亚型：Akt1，Akt2，Akt3。在这三种亚型之间，PH区序列有约80%一致性，CAT区序列有约90%一致性，EXT区约为70%，而PH区和CAT区之间的连接区（LINK）则呈低保守性，三种亚型之间仅仅有17%～46%一致性[9]。由于缺乏特异性的阻断剂，我们还无法了解Akt1、2、3三个亚型中的每个亚型准确作用。

RNA干扰（RNAi）是一种新的基因阻断方法[10]，其作用机制是将与mRNA序列同源互补一些短片断的双链RNA（shRNA、siRNA）导入细胞，从而使特定的mRNA发生降解，导致其基因沉默。RNAi抑制基因表达具有高效﹑特异和级联式放大效应，因而它更适合恶性肿瘤的研究和基因治疗。

慢病毒载体是一种新近开发的、极具应用前景的基因转移系统。利用慢病毒构建的shRNA载体，可以更高效地转染传统试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在转染后整合到受转染细胞基因组，从而长时间稳定地抑制特定基因的表达[11]。

本研究通过成功构建靶向人Akt1基因的shRNA 及其慢病毒表达载体，确定最适合的SGC-7901慢病毒MOI值并转染SGC-7901细胞。其最大特点是可稳定整合于靶细胞的基因组，治疗基因表达时间长[10]。本研究表明，转染后S-LV-A细胞的Akt1 mRNA和蛋白的表达量较转染S-LV-C细胞和未转染细胞明显减少，而S-LV-C和SGC-7901细胞Akt1 mRNA和蛋白的表达量比较无明显变化，說明表达载体具有特异性沉默Akt1基因的作用。该载体转染SGC-7901细胞后，细胞生长显著受到抑制，并出现明显的凋亡改变[凋亡率为（38.7±3.5）%]，说明阻断Akt基因的亚型Akt1有促凋亡作用，进一步证实了shRNA对靶基因的抑制作用。同时本研究发现慢病毒靶向携带shRNA转染SGC-7901细胞后，活性形式的Akt即磷酸化Akt（phospho-Akt）蛋白和bcl-2蛋白表达明显减少，提示SGC-7901细胞存在PI3K/Akt信号途径的异常活化，抑制该通路可以诱导细胞出现明显凋亡。其机制与沉默Akt1基因后，PI3K依赖性的磷酸化Akt（p-Akt）表达下调，抑制其下游bcl-2家族成员bcl-2表达，诱导线粒体调亡通路激活有关[12-15]。

本实验利用RNAi技术，有效敲低胃癌细胞Akt1的表达，发现其可抑制胃癌细胞生长，诱导细胞发生凋亡，其机制与抑制PI3K/Akt通路活化，激活线粒体凋亡通路有关。Akt1基因是比较理想的肿瘤生物治疗的靶点，为胃癌的基因治疗提供了新的思路。

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（收稿日期：2017-03-10 本文编辑：苏 畅）