超高效液相色谱-质谱法测定金属罐内壁涂层中三聚氰胺及其类似物迁移检测技术研究

张雷雷，夏静，关书会，张京, 张岩(.河北省食品检验研究院，河北省食品安全重点实验室,河北 石家庄 05009；.河北冠卓检测科技有限公司，河北 石家庄 05009)

超高效液相色谱-质谱法测定金属罐内壁涂层中三聚氰胺及其类似物迁移检测技术研究

张雷雷1，夏静1，关书会1，张京2, 张岩1
(1.河北省食品检验研究院，河北省食品安全重点实验室,河北 石家庄 050091；2.河北冠卓检测科技有限公司，河北 石家庄 050091)

本研究建立了金属罐体内层涂料中三聚氰胺、三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺的超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法检测技术。通过对不同提取溶液模拟金属灌装饮料的生产流程，对其中模拟物进行测试，采用正离子扫描和负离子扫描的方式进行仪器条件研究，确定了三聚氰胺、三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺的监测模式和特征离子对，并进行了MRM模式定性定量分析。该方法的检出限为5.0～25μg/L; 线性范围0.5～200μg/ L内，相关系数均大于0.995。实验结果表明，灌装饮料使用的金属罐在特定条件下会发生三聚氰胺的迁移，存在食品安全风险，同时未检出其类似物的存在。

三聚氰胺；三聚氰胺类似物；液相色谱-串联质谱法

引言：

自“三鹿”事件以来，对于奶制品乃至食品中三聚氰胺的分析方法已出现了很多种[1]，但国内对于三聚氰胺的分析方法大多集中在对三聚氰胺单一化合物的分析[2-4]。随着西方发达国家在对宠物食品产品的检测结果表明除三聚氰胺以外[5]，其类似物——三聚氰胺二酰胺、三聚氰胺一酰胺及三聚氰酸的存在也会导致动物及人体受到健康威胁[6]。研究表明除去人为添加因素，目前唯一能直接带入到食品中的途径是通过食品包装材料。发生这一现象的原因与三聚氰胺在工业上被广泛应用有关[7]。世界各国特别是美国、欧盟、日本等发达国家的分析与研究结果表明，与食品接触的器皿、餐厨具和包装容器以及包装材料中有害元素、有害物质会迁移至食品中，这一现象已成为人们对食品安全一个新的关注点[8]。针对这一事实，欧盟早在2002年就在DirectiveECNo2002/72中规定，三聚氰胺及其类似物在食品接触材料中的迁移量不超过30mg/kg[9]，我国于2009年9月1日实行的GB9690-2009《食品容器、包装材料用三聚氰胺-甲醛成型品卫生标准》规定三聚氰胺单体迁移量为0．2mg/dm2(条件为4%乙酸水，60℃，2h)[10]。而我国目前针对食品容器中三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺和三聚氰胺二酰胺的有关报道很少，多集中在对三聚氰胺的迁移进行的报道[11-13]。

本研究依据GB23296.1-2009中规定的四种食品模拟物进行三聚氰胺及其类似物的迁移试验[14]。通过试验比对发现，如果严格按照相关国家卫生标准的试验条件对包装容器进行检测，一般不会发生三聚氰胺迁移或迁移量很小，但是如果按照食品生产过程中要使用的温度条件对同样的包装材料进行前处理，会发生三聚氰胺迁移，而且采用不同的提取溶剂其迁移量会有不同程度的变化，这将为食品行业带来一定的安全隐患。因此本试验结果不仅可以为食品包装材料生产企业、食品生产加工企业提供一定的技术支持，而且为食品中三聚氰胺及其类似物的非人为添加来源研究提供最新试验数据，为相关国家标准改进提供试验依据。

1 实验部分

1.1 主要仪器和试剂

高效液相色谱仪：LC-30AD型，日本岛津公司；

三重四级杆串联质谱仪：8030型，日本岛津公司；

高速冷冻离心机：RT15T高速冷冻离心机，上海天美公司；

氮吹仪：美国Organomaion Assiciates公司；

超声波水浴器：德国IKA公司。

甲醇、乙腈、乙酸、乙醇：色谱纯；

三聚氰胺标准品：购自瑞士Fluka公司，纯度≥99.0%;

三聚氰酸标准品：购自瑞士Fluka公司，纯度≥98.0%;

三聚氰酸一酰胺标准品：购自德国Dr.Ehrenstorfer公司，纯度≥99%;

三聚氰酸二酰胺标准品：购自瑞士Fluka公司，纯度≥97.7%。

标准溶液的储备液：分别称量10.0mg(精确到0.1mg)的标准品，三聚氰胺(MEL)、三聚氰酸(CYA)、三聚氰酸一酰胺(ADE)和三聚氰酸二酰胺(ANE)用二乙胺+水(20+80)溶液进行溶解，并用乙腈水(50+50)溶液配成浓度均为1000μg/mL的溶液。

混合标准中间溶液：分别移取四种标准储备液1.0mL于100mL容量瓶中，用提取剂定容，充分摇匀，配制浓度为10.0μg/mL的混合标准液的中间溶液。0℃～4℃冷藏避光保存，有效期1个月。

标准溶液工作曲线：用流动相将三聚氰胺及其类似物标准储备液稀释成浓度为10μg/mL的标准使用混合溶液，再逐级稀释得到三聚氰胺浓度为0.5μg/L，1.0μg/L，5μg/L，10μg/L，20μg/L，50μg/L，；三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺浓度为1.0μg/L，5.0μg/L，10μg/L，20μg/L，50μg/L，100μg/L；三聚氰酸二酰胺浓度为2μg/L，10μg/L，20μg/L，40μg/L，80μg/L，160μg/L的标准工作液。

1.2 试验方法

1.2.1 样品

空白罐体由两个厂家提供,均为金属罐体。

1.2.2 食品模拟物的选择

本实验中选取了水、65%乙醇水、4%乙酸水及橄榄油标准品作为食品模拟物。

1.3 实验条件

1.3.1 浸泡条件

本次试验中选取水、65%乙醇水、4%乙酸及橄榄油作为食品模拟物，各取四种模拟物250mL于金属罐中，将金属罐放于生产流水线中密封并模拟生产过程，其后选取装有橄榄油的金属罐置于95℃下浸泡24h，其他三种模拟物的金属罐置于70℃下浸泡2h。之后取出各种提取液待测。

1.3.2 样品前处理

将1.3.1中得到的水、65%乙醇水、4%乙酸三种模拟物混匀后用0.22μm的有机滤膜直接过膜进样品瓶中，待分析；准确称取橄榄油模拟提取物5.0g，先加入5mL异辛烷，充分混合，后加入5mL10%异丙醇，70℃水浴振荡40min，离心，分层，取下层，过0.22μm的有机滤膜，装入样品瓶中待测。

1.3.3 色谱条件

Waters ACQUITY UPLC BEH HILIC柱(50mm×2.1mm，1.7μm);流动相:10mmol/L乙酸铵水溶液+乙腈，洗脱条件见表1，为梯度洗脱，流速为0.3mL/min;柱温:25℃;进样量:1μL。

表1 HPLC梯度洗脱条件

1.3.4 质谱条件

实验采取电离方式是电喷雾电离，扫描方式是正离子模式和负离子模式同时扫描：离子喷雾电压:4kV;雾化气和干燥气均为氮气，雾化气压力为0．28MPa;干燥气流速:15L/min，雾化器流速：3L/min；温度400℃;碰撞气为氮气，压力为0．2MPa;扫描方式为多反应检测(MRM)。

2 结果与讨论

2.1 液相色谱条件优化

三聚氰胺及其类似物的相对分子质量较小，而且分子结构均含有氨基，具有较强的极性和亲水性，因此很难在传统的C8和C18反相色谱柱有所保留，而对于常用来分离三聚氰胺的强阳离子交换柱利用的是阳离子交换和反相保留的机理，但也仅对三聚氰胺类阳离子化合物有很强的保留，对于三聚氰酸不能保留[16]。亲水作用分离色谱是一种能够针对极性化合物分离的理想的方法，在亲水色谱系统中，有机溶剂为弱洗脱溶剂，水溶剂为强洗脱溶剂[17]。该实验则采用了Waters ACQUITY UPLC BEH HILIC柱、选取乙酸铵缓冲溶液作为水相，乙腈作为有机相进行分离优化，并通过降低乙腈的比例来实现亲水色谱柱对于物质的保留，而结果显示，三聚氰酸因其结构特性会最先出峰，随着乙腈比例的不断变化，三聚氰胺和三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸二酰胺的分离峰形尖锐。因此得到的梯度洗脱条件可以在1.5分钟内实现四种物质的分离。其TIC总离子流图可见图1所示。

图1 三聚氰胺及其类似物的TIC总离子流图

2.2 质谱条件优化

分别对三聚氰胺及其类似物在正、负离子模式下进行了母离子全扫描，仔细分析所得到的一级质谱图分析得出，三聚氰胺正离子模式下的离子峰强度比负模式下离子峰强度高出2-3个数量级，而三聚氰酸则不同，三聚氰酸一酰胺和三聚氰胺二酰胺在正负模式下的分子离子峰的强度相差不大，于是最终选定在正模式下进行试验。三聚氰胺、三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺、三聚氰胺二酰胺的母离子峰分别为m/z 127.1、m/z 127.85、m/z 129.1、m/z128.1，再分别对母离子进行子离子扫描，选择丰度最强的碎片离子m/z85.00、m/z41.90、m/z87.00、m/z86.00作为定量离子，其MRM图2中所示。具体的质谱分析多反应检测条件见表2所示：

表2 三聚氰胺及其类似物的MRM监测条件

图2 三聚氰胺及其类似物的MRM质谱图及子离子扫描图

2.3 线性方程与检出限

配制三聚氰胺及其衍生物系列浓度的标准工作溶液，并按照前述方法进行处理和测定。以被分析目标物质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，分别得到MEL，ANE，ADE和CYA的检出限、线性范围、相关系数和线性方程，详见表3中。

表3 不同模拟物中三聚氰胺及其衍生物的检出限及线性方程

2.4 提取溶剂的选择与实际罐体的测定

国家标准GB9690-2009、GB/T23296.1-2009的迁移实验列表中，选取了四种模拟物(水、65%乙醇水、4%乙酸水及橄榄油)于70℃浸泡2h的替代试验条件，而由于三聚氰胺单体的迁移量，尤其在橄榄油中的迁移量较低，使用已有的国家标准方法对食品模拟物中的三聚氰胺单体分析时，测定下限较高，大部分的迁移测定结果都处于未检出的状态，为了更好的研究金属罐中三聚氰胺及其类似物的迁移研究，将橄榄油中迁移实验的浸泡温度升至95℃并延长浸泡温度至24h，通过对四种溶剂中三聚氰胺及类似物的含量进行测定，结果见表3所示，可以得出65%乙醇水在对罐体中对三聚氰胺及其类似物的提取效果最好，可以用来对金属罐体进行筛选研究。

通过65%乙醇水对金属罐体中三聚氰胺及其类似物的提取实验结果可以看出，金属罐体的内壁三聚氰胺涂层中可以检出有微量的三聚氰胺，而并未检出三聚氰酸和三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸二酰胺，从而可以推断出食品用带三聚氰胺涂层的金属罐体在生产的过程中不会产生三聚氰胺的类似物。而三聚氰胺的迁移量也因生产厂家不同，含量有所不同。

表4 不同提取溶剂对实际金属罐中三聚氰胺及其类似物的测定实验结果

注：N.D.表示未检出,当检验结果低于检出限时均为未检出。

3 结论

通过应用本方法针对金属罐内层涂料的三聚氰胺及其类似物进行检测，找到了适合检测的最佳提取试剂，并发现确实存在三聚氰胺的迁移，而其它其类似物并未发现有残留，这不仅说明了市售饮料灌装用的金属罐存在着将三聚氰胺迁移至饮料中的危险，同时也印证了饮料生产过程由于不存在三聚氰胺向类似物转化的条件而并未检出三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺。因此，可提醒广大饮料企业在选择金属罐的过程中要关注涂层中三聚氰胺的含量，并应该严格控制生产过程中的各个环节，防止三聚氰酸等类似物的出现进而危害消费者的健康。

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Determination of melamine and analogues in Food contact materials by liquid chromatography tandom mass spectrometry

ZHANG Lei-lei，XIA Jing，GUAN Shu-hui，ZHANG Jing，ZHANG Yan
(1.HebeiFoodInspectionAndResearchInstitute，HebeiFoodSafetyKeyLaboratory，ShijiazhuangHebei050091,China;2.HebeiGuanzhuoDestingTechnologyCo,LtdShijiazhuangHebei050091,China)

A new method using liquid chromatography Tandom Mass Spectrometry to analyse migration of melamine, cyanuric acid, ammelide cyanuric acid amide in metal tank inner coatings.Through a series of experiments to simulate metal filling beverage production process with different extraction solution, we got a conclusion that it will cause migration of melamine in the food producing, packaging and sterilization.The electrospray ionization source in positive and negative ion mode was used for multiple reaction monitoing mode.These four componnts showed good liner relationships with the correlation coefficients more than 0.995.The limits of detection were all in the range of 5.0～25μg/L.These will bring food safety problem which can not be ignored.The experimental results showed that melamine can be detected but its analogues does not exsit in the tank.

Melamine; Melamine analogues; Liquid chromatography-tandem mass spectrometry

2017-05-12

张雷雷(1977-),男，山西长治市人，主要从事食品安全检测技术研究.

张 岩，E-mail:zhangyan@nepp.con.cn

1001-9383(2017)02-0052-09

O657.6

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