固相萃取-高效液相色谱法测定植物油中苯并(a)芘

范素芳，马俊美，俞婧，王娟，刘红冉，李强，张岩(河北省食品检验研究院 河北省食品安全重点实验室，河北 石家庄 050004)

固相萃取-高效液相色谱法测定植物油中苯并(a)芘

范素芳，马俊美，俞婧，王娟，刘红冉，李强，张岩
(河北省食品检验研究院 河北省食品安全重点实验室，河北 石家庄 050004)

本实验建立了基于固相萃取的高效液相色谱法测定植物油中苯并(a)芘含量。样品用正己烷溶解，经Cleanert BAP-3固相萃取小柱净化，采用C18色谱柱分离，以乙腈/水=80/20(V/V)为流动相，经荧光检测器检测。结果表明苯并(a)芘在0. 50 μg /L ～ 50 μg /L浓度范围内线性良好，相关系数为0. 9999，方法检出限为0. 1 μg /kg，样品加标回收率为89.00% ～ 94.46%，RSD为1.0% ～ 2.2%。该方法具有快速、准确、灵敏、简单等特点，可用于植物油中苯并芘的检测。

固相萃取；高效液相色谱法；植物油；苯并(a)芘

苯并(a)芘又称3,4-苯并芘，是由苯环和芘分子结合而成的多环芳烃类化合物[1]，具有高度脂溶性[2]，并且性质稳定, 不易降解，是常见的高活性间接致癌物的一种，苯并(a)芘具有致畸、致突变作用[3]。植物油是人类食用频率最高的食物之一，在油料作物的种植、加工、运输和烹调的过程中，容易污染苯并(a)芘[4-5]，虽然含量通常较低，但其毒性较大，对油脂的营养品质和人体健康都造成的不容忽视损害。因此，许多国家和地区都规定了食用油脂中苯并(a)芘的最大残留限量，欧盟629/2008号文件规定苯并(a)芘的最大残留限量为2μg/kg，我国GB2716-2005《食用植物油卫生标准》中规定为10μg/kg[6]。

近年来，食用植物油中苯并(a)芘超标的食品安全事件时有发生[7-9]，引发了政府和公众对食用植物油中苯并(a)芘食用安全问题的强烈关注。目前，植物油中苯并(a)芘含量的检测方法主要有薄层层析法、荧光分光光度法、高效液相色谱法和气相色谱-质谱联用法等[10-15]。其中，薄层层析法和荧光分光光度法操作步骤繁多且灵敏度较低；气质联用技术的分离效果及色谱重现性好，但对仪器要求比较高，不利于推广[16]。高效液相色谱法的分离效果好，灵敏度高，且容易推广，近年来我国制定的标准GB/T22509-2008中也是采用高效液相色谱法，但其存在成本高，耗时长，操作繁琐，重现性差等问题，因此建立一种科学快速且准确可靠的检验方法是十分必要的。

本实验采用Cleanert BAP-3固相萃取柱对植物油进行提取净化，再用高效液相色谱-荧光检测法进行检测，简化了处理步骤，降低了实验成本和有机试剂排放量，实现了植物油中苯并(a)芘的快速精确测定。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

LC-30AD超高效液相色谱仪(日本SHIMADZU公司) ；12位固相萃取仪(Agilent 公司)；IKA Vortex Genius 3旋涡混合器(德国IKA公司)；Bond Elut ENV固相萃取柱(500 mg/6 mL，Agilent公司) ；Cleanert BAP-3固相萃取柱(500 mg /6 mL，博纳艾杰尔公司)；FLorisil PR(1000 mg/6 mL，北京振翔工贸有限公司) ；C18固相萃取柱、硅胶固相萃取柱、HLB固相萃取柱均购自美国Waters公司。

色谱纯乙腈、正己烷和二氯甲烷(美国Merck 公司) ；苯并(a)芘标准品(纯度99. 3% ，美国Supelco公司)。水为实验室自制的二级水，符合GB/T6682规定。

1.2 色谱条件

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美国Waters公司)；流动相：乙腈:水=80:20；流速：0.3 mL/min；进样量：1μL；检测波长：Ex:384 nm，Em:406 nm。

1.3 样品的前处理

1.3.1 试样提取

称取0.5g食用植物油试样(精确到0.001g)于15mL离心管中，加入3mL正己烷，涡旋充分混匀，待净化。

1.3.2 试样净化

将Cleanert BAP-3固相萃取柱用5 mL二氯甲烷，5 mL正己烷活化，将待净化液上样，以2 mL 正己烷润洗样品管，保证完全上样，再用10 mL正己烷淋洗固相萃取柱，最后用5 mL二氯甲烷洗脱，收集洗脱液，于40 ℃下氮气吹干，用1. 00 mL乙腈定容，超声10 s，过0. 22μm有机系微孔滤膜，供液相色谱荧光检测法检测。

2 结果与分析

2.1 固相萃取柱的选择

食用油中的苯并(a)芘的萃取常采用混合溶剂，但由于苯并(a)芘的脂溶性较强导致萃取时提取效率不高；另一种方法是在油脂中加入碱性溶液，经皂化反应除脂后再用溶剂提取，但皂化反应时间长，一般2 h 以上，导致样品检测时间过长。为简化操作，提高检测效率，考虑将植物油样品溶解后，直接进行固相萃取净化。

本实验考察了添加量为10 μg/kg时Bond Elut ENV 、Cleanert BAP-3、FLorisil PR、C18、硅胶和HLB固相萃取柱对苯并芘的保留和净化能力，结果如图1。研究表明Cleanert BAP-3固相萃取柱对样品进行前处理，回收率最高，且干扰较小。Cleanert BAP-3是一种以聚苯乙烯二乙烯苯高聚物为填料的新型固相萃取柱，利用了高聚物苯环和苯并芘之间的π-π作用，能对样品起到很好的净化效果。故选择Cleanert BAP-3固相萃取柱为净化小柱。Cleanert BAP-3柱净化色谱图如图2所示。

图1 不同固相萃取柱对苯并芘的回收率

图2 阳性样品的Cleanert BAP-3柱净化色谱图

2.2 称样量的选择

在考察称样量时，通过加标回收率实验确定称样量对回收率的影响。加标量为10 μg/kg，计算称样量分别为0.2 g、0. 5 g、1.0 g、1.5 g、2.0 g时苯并芘的回收率，结果(图3)表明，称样量大于0.5 g时，称样量对回收率有显著影响，称样量提高，回收率降低，原因可能是固相萃取柱的承载量有限，称样量过大，会造成萃取柱过载，从而造成回收率偏低；称样量小于0.5 g时，称样量对回收率影响较小，考虑到适当的增大称样量，可以减少因称量设备精度等造成的误差，故本实验称样量选为0.5 g。

图3 不同称样量对苯并芘的回收率

2.3 标准曲线的绘制和检出限

苯并芘标准品用甲苯溶解后，用乙腈配成10 mg/L储备液，分取储备液再稀释成0. 5、1. 0、5. 0、10. 0、20.0、50.0μg /L，将标准系列溶液在上述色谱条件下进行测定，以浓度为横坐标(X)，相应峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归 ，苯并芘在0. 5～50.0 μg/L浓度范围内有良好的线性，回归方程为Y=12723.3X-2730.22，R2=0. 9999。以仪器信噪比(S/N) 为3时所对应的标准溶液浓度为仪器的检出限，根据前处理方法计算方法的检出限为0.1μg /kg。

2. 4 回收率和精密度

在植物油样品中添加苯并芘标准溶液，添加水平分别为1μg/kg、5μg/kg和10μg/kg，每个浓度做6个平行，回收率及精密度数据如表1 所示，加标回收率在89.00%～94.46%范围内，相对标准偏差不高于2.2%，满足残留检测的要求。

表1 样品回收率及精密度

2. 5 实际样品测定

利用本方法对市售的食用植物油样品30批进行测定，包括花生油、大豆油、棉籽油、香油等样品，检测时均无干扰，色谱分离良好，其中16批样品未检出苯并芘，13批样品检出苯并芘，含量不超过10. 0μg /kg，1批样品检出含量超过10μg/kg，为12.81μg/kg，用GB/T 22509-2008规定的方法对此样品进行了测定，检测结果与本方法结果一致，证明本方法准确可靠、适用性强。

3 结论

建立了固相萃取-高效液相色谱荧光检测器测定食用油中苯并芘的方法。样品过Cleanert BAP-3固相萃取柱净化，采用C18反相色谱柱分离，回收率及精密度均获得满意结果，该法方便、快捷、灵敏，可满足日常检测要求，有较大的推广应用前景。

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Determination of the benzo(a) pyrene in vegetable oil by high performance liquid chromatography based on solid phase extraction

FAN Su-fang, MA Jun-mei, YU Jing,Wang Juan, LIU Hong-ran,LI Qiang, ZHANG Yan
(HebeiFoodInspectionandResearchInstitute,KeyLaboratoryofFoodSafetyofHebei,ShijiazhuangHebei050004,China)

In this experiment, a high performance liquid chromatography method was built to determine benzo(a) pyrene in vegetable oil based on solid phase extraction. Samples were extracted with hexane，then cleaned-up using Cleanert BAP-3 solid phase extractionl column，and separated on an C18 column using a mobile phase consisting of acetonitrile and water(V/V=80:20) by gradient elution. Finally the benzo( a) pyrene was detected with FLD.The benzo(a) pyrene showed good linearity in the range of 0. 50μg/L～50 μg/L(R2=0.9999).The limit of detection was 0.1 1μg/kg.The recoveries were 89.00%～94.46%，and the RSD was 1.0%～2.2%.The method was rapid，accurate，sensitive and simple，it could be applied to the quantification of benzo(a) pyrene in vegetable oil.

Solid phase extraction; High performance liquid chromatography; Vegetable oil; Benzo(a) pyrene

2017-04-28

范素芳(1985-)，女，博士，工程师，研究方向为食品检验.

张 岩(1979-)，男，博士，正高级工程师，研究方向为食品安全.

1001-9383(2017)02-0047-05

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