4种保存液对犬红细胞低温保存效果的比较

李 燕， 王昌虹， 刘新峰， 郝志明， 丁向彬

(天津农学院动物科学与动物医学学院，天津 300384)

4种保存液对犬红细胞低温保存效果的比较

李 燕， 王昌虹， 刘新峰， 郝志明， 丁向彬*

(天津农学院动物科学与动物医学学院，天津 300384)

犬类红细胞低温保存具有较大的临床应用价值，犬红细胞低温保存液对犬红细胞低温保存的时间和保存效果具有重要影响，该实验选用CPDA-1、CPDA-2、CPDA-3和MAP保存液对犬红细胞进行4 ℃下低温保存，于保存的第0、10和20天分别检测各组红细胞样品的红细胞数及K+、Na+和Cl-的浓度，对低温保存效果进行比较，以寻找适合犬红细胞低温保存的保存液。结果表明：选用MAP保存液对犬红细胞进行保存时，红细胞相对减少量显著低于其它组(P<0.05)，红细胞样品中K+浓度的相对增加量显著低于其它组(P<0.05)，Na+和Cl-浓度的相对减少量显著低于其它组(P<0.05)，说明MAP保存液较适合用于犬红细胞的低温保存。

犬；红细胞；低温保存；红细胞保存液

随着养犬人群的日益增长，犬的健康问题得到了越来越多的关注，当犬出现贫血、失血及严重感染性疾病时必须紧急输血，输血疗法是抢救这些危重病例最有效的方法。输血可以起到迅速补充循环血量、维持一定血压、增加血液的凝固性和血红蛋白的浓度、增加血液运输氧的能力以及刺激机体的造血机能等作用。但是新鲜血源并不容易找到，要依靠血库提供可用血液，目前在发达国家已有商业性动物血库或中心，而我国在这方面的工作亟待开展。延长犬血液的保存期限，避免血资源浪费，显得尤为重要。存放时间和温度对血液中红细胞的功能具有较大的影响[1-2]。红细胞保存有4 ℃下的短期保存和-80 ℃或-196 ℃深低温长期保存，前者保存期为35～42 d，由于保存期短，往往造成大量红细胞的浪费，后者保存期可长达10年，但应用于临床耗时费力，保存费用昂贵，仅用于稀有血型的保存。经历了从常温保存到低温保存再到深低温保存的长期发展，人体血液的保存技术已经日趋成熟。红细胞低温保存研究在人上进行的比较多，犬类红细胞低温保存的研究还比较少。在人红细胞4 ℃低温保存研究中使用过的保存液有ACD保存液、CPD保存液、CPDA保存液和MAP保存液等[3-5]。这些保存液对犬红细胞低温保存的效果还需要进一步研究，本实验选用人类的红细胞保存液(MAP保存液、CPDA-1保存液、CPDA-2保存液、CPDA-3保存液)对犬的红细胞进行低温保存研究，以期找到适合犬红细胞低温保存的保存液，延长犬红细胞低温保存的时间，为犬红细胞低温保存研究及动物血库建立提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 动物

健康雄性犬，3岁，临床检查血液相关指标正常，无受血经历。

1.2 试剂

氯化钠、葡萄糖、甘露醇、腺嘌呤、磷酸二氢钠、柠檬酸钠、柠檬酸，均购自天津北方化玻采购销售中心。

1.3 液体配制

1) CPDA-1红细胞保存液 柠檬酸钠2.63 g，柠檬酸0.327 g，磷酸二氢钠0.222 g，葡萄糖3.19 g，腺嘌呤0.027 g，加蒸馏水至100 mL。

2) CPDA-2红细胞保存液 柠檬酸钠2.63 g，柠檬酸0.327 g，磷酸二氢钠0.222 g，葡萄糖4.46 g，腺嘌呤0.054 g，加蒸馏水至100 mL。

3) CPDA-3红细胞保存液 柠檬酸钠2.63 g，柠檬酸0.327 g，磷酸二氢钠0.222 g，葡萄糖5.1 g，腺嘌呤0.054 g，加蒸馏水至100 mL。

4) MAP红细胞保存液 葡萄糖0.793 g，磷酸二氢钠0.094 g，氯化钠0.497 g，甘露醇1.457 g，柠檬酸钠0.15 g，腺嘌呤0.014 g，柠檬酸0.02 g，加蒸馏水至100 mL。

1.4 血液采集及低温保存红细胞样品制备

用加入相应比例抗凝剂(3.8%柠檬酸钠溶液，与血液比例为1∶9)的注射器采集犬前肢内侧静脉血液，离心收集红细胞，以3 000 r/min离心10 min，弃上清液，制成浓缩红细胞。将浓缩红细胞分为4组，每组按1∶1比例加入CPDA-1保存液、CPDA-2保存液、CPDA-3保存液和MAP保存液，每组样品分装到9个保存管中，将添加各种不同保存液的红细胞放入4 ℃冰箱中密封保存。于保存的第0、10和20天分别检测各组红细胞样品的红细胞数量及K+、Na+和Cl-的浓度。

1.5 红细胞计数及K+、Na+和Cl-浓度测定

吸取10 μL各组红细胞样品，用900 μL 0.9%生理盐水稀释，然后采用血细胞计数板对各组红细胞进行计数。

吸取500 μL各组红细胞样品，3 000 r/min离心10 min，吸出上清，采用IMS-972电解质分析仪检测上清中K+、Na+和Cl-的浓度。

1.6 统计学分析

本实验数据使用SPSS 17.0软件进行分析，数据资料分析以均值±标准差(x±sd)表示，P<0.05表示有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 不同保存液对低温保存后红细胞数量的影响

通过红细胞计数法对4种保存液中红细胞的数量进行计数，由表1可知，随着保存时间的延长，各组低温保存样品中红细胞数量与保存前(第0天)样品中红细胞数量相比均有不同程度的下降。各组之间红细胞的相对减少量均差异显著(P<0.05)。其中,CPDA-3组的红细胞减少量最高，MAP组的红细胞减少量最低，说明MAP保存液较适合用于犬红细胞的低温保存。

表1 不同保存液中红细胞数量变化

注：同列中不同小写字母表示差异显著(P<0.05),红细胞减少量为第20天和第0天比较。

2.2 不同保存液对低温保存红细胞样品中K+浓度的影响

采用电解质分析仪检测4组红细胞样品上清中K+的浓度。由表2可知，随时间的延长各组红细胞样品上清中K+浓度均呈上升趋势，各组低温保存样品中K+浓度与保存前(第0天)样品中K+浓度相比均有不同程度的上升。其中,CPDA-3组K+浓度的相对增加量最高，MAP组K+浓度的相对增加量最低，MAP组与其它各组均存在显著差异(P<0.05)，说明MAP保存液较适合用于犬红细胞的低温保存。

表2 不同保存液中K+浓度变化

注：同列中不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。K+相对增加量为第20天和第0天比较。

2.3 不同保存液对低温保存红细胞样品中Na+和Cl-浓度的影响

采用电解质分析仪检测4组红细胞样品上清中Na+的浓度。由表3可知，随时间的延长各组红细胞样品上清中Na+浓度均呈下降趋势，各组低温保存样品中Na+浓度与保存前(第0天)样品中浓度相比均有不同程度的下降。其中,CPDA-3组Na+浓度的相对减少量最高，MAP组Na+浓度的相对减少量最低，MAP组与其它各组均存在显著差异(P<0.05)。

表3 不同保存液中Na+浓度变化

注：同列中不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，Na+相对减少量为第20天和第0天比较。

采用电解质分析仪检测4组红细胞样品上清中Cl-的浓度。由表4可知，随时间的延长各组红细胞样品上清中Cl-浓度均呈下降趋势，各组低温保存样品中Cl-浓度与保存前(第0天)样品中浓度相比均有不同程度的下降。其中,CPDA-3组Cl-浓度的相对减少量最高，MAP组Cl-浓度的相对减少量最低，MAP组与其它各组均存在显著差异(P<0.05)。

表4 不同保存液中Cl-浓度变化

注：同列中不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，Cl-相对减少量为第20 天和第0天比较。

3 讨论

红细胞形态学的改变影响和反映了红细胞质量及回输后的功能。红细胞在保存过程中，随着保存时间的延长，红细胞会发生保存损伤[6-7]和细胞老化现象。红细胞突然接触血袋中的高渗或低渗溶液、抗凝剂和添加剂，或溶液pH值发生骤变，都可能引起红细胞渗透脆性增高或红细胞的破坏。有研究表明，随着红细胞保存时期的延长，超氧化物歧化酶活性下降，使红细胞内自由基清除效率降低，红细胞膜的脂质过氧化，膜结构和功能被破坏，进而使红细胞损伤和死亡[8]。也有研究表明，红细胞保存过程中ATP水平的下降会影响红细胞膜上ATP酶的活性，造成红细胞的损伤，使红细胞存活率下降[9]。红细胞膜结构的破坏容易导致红细胞溶血，随着保存时间的延长，溶血现象逐渐严重，红细胞的数目也相应地不断减少。在红细胞低温保存研究中，研究者们开发出了多种红细胞保存液，比如ACD保存液(柠檬酸+柠檬酸钠+葡萄糖)、CPD保存液(柠檬酸+柠檬酸钠+葡萄糖+磷酸盐)、CPDA保存液(柠檬酸+柠檬酸钠+葡萄糖+磷酸盐+腺嘌呤)和MAP保存液(柠檬酸+柠檬酸钠+氯化钠+腺嘌呤+葡萄糖+甘露醇+磷酸盐)[3-5]。保存液是血细胞保存的外部环境，保存体系的成分组成，以及各种理化性质如电导率、渗透压、pH值等对于细胞的代谢和氧化作用影响很大[10]。合适的保存液对改善血细胞保存质量，延长血液保存时间有着重要的意义。

本实验选用CPDA-1、CPDA-2、CPDA-3和MAP保存液对犬的红细胞进行4 ℃下低温保存，以寻找适合犬红细胞保存的保存液，试验结果表明，随着红细胞保存时间的延长，各保存液组的溶血现象都逐渐加重，红细胞的数量也不断减少，溶血现象逐渐严重。其中，MAP组的红细胞数目减少量最少，说明从保存后红细胞的数目看，MAP保存液的保存效果最好。

钾是生命所必需的无机离子之一，对人和动物机体极其重要，血清钾的高低对机体的影响较大，红细胞内钾浓度约为105 mmol/L，血清中钾浓度仅为3.5～5.5 mmol/L，红细胞内钾浓度约为血清钾浓度的20倍。在红细胞保存过程中，K+浓度可以反映出红细胞破坏的程度。随保存时间延长红细胞膜上的脂蛋白及脂质逐渐丧失，红细胞内K+逐渐释放至红细胞外，致使红细胞悬液的K+含量升高[11]。本试验结果发现，采用不同的保存液对犬红细胞进行低温保存后，随着保存时间的延长各组K+浓度逐渐升高，在保存的第10天和第20天红细胞样品中K+浓度均高于保存前K+的浓度，说明保存后红细胞确实有不同程度的破坏。其中，MAP组K+浓度的相对增加量最低，说明MAP保存液较适合用于犬红细胞的低温保存。

钠有维持血压的功能，钠调节细胞外液容量，构成细胞外液渗透压，细胞外液钠浓度的持续变化对血压有很大影响。体内水量的恒定主要靠钠的调节。有研究表明，在红细胞体外保存过程中，随着保存天数的增多，红细胞悬液中的Na+和Cl-含量随着保存期延长而逐渐降低[11-12]。这可能是由于保存后红细胞受不同程度的破坏，红细胞悬液的K+含量升高，Na+和Cl-浓度的下降有助于维持红细胞内外的离子浓度平衡。本试验结果发现，用不同的保存液对犬的红细胞进行低温保存后，随着保存时间的延长各组Na+和Cl-浓度逐渐降低，在保存的第10天和第20天红细胞样品中Na+和Cl-浓度均低于保存前的浓度，随着保存时间的延长，红细胞内外离子浓度变化加剧，这种离子浓度的变化可能会对红细胞的形态和脆性造成影响，使其更易发生溶血。本试验中，MAP组Na+和Cl-浓度的相对减少量最低，说明MAP保存液较适合用于犬红细胞的低温保存。

4 结论

本试验选用CPDA-1、CPDA-2、CPDA-3和MAP保存液对犬的红细胞进行4 ℃下低温保存，通过红细胞样品中红细胞数及K+、Na+和Cl-的浓度变化检测对犬红细胞低温保存的效果进行研究。试验结果表明，选用MAP保存液对红细胞进行保存时，红细胞相对减少量、红细胞样品中K+浓度的相对增加量、Na+和Cl-的相对减少量均显著低于其它组，说明MAP保存液中红细胞破坏较少，红细胞内外离子浓度变化较小，有利于维持红细胞的正常形态，比较适合用于犬红细胞的低温保存。

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Effects of four different preservation solutions on low-temperature preservation of canine erythrocyte

LI Yan, WANG Changhong, LIU Xinfeng, HAO Zhiming, DING Xiangbin*

(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,TianjinAgriculturalUniversity,Tianjin300384,China)

Low-temperature preservation of canine erythrocyte has important clinical value，the preservation solution plays an important role in canine erythrocyte preservation. In this study, four different preservation solutions (CPDA-1, CPDA-2, CPDA-3 and MAP) were used for canine erythrocyte preservation at 4 ℃, the proper preservation solution was selected according to the erythrocyte number and K+, Na+and Cl-concentrations. The results showed that the erythrocyte number in preservation solution was decreased, and the reduction number of erythrocyte in MAP group was significantly lower than that of other groups (P<0.05). The K+concentration in preservation solution was increased, but the K+augmenter in MAP group was significantly lower than that of other groups (P<0.05). The Na+/Cl-concentration in preservation solution was decreased, but the Na+/Cl-concentration decrements in MAP group was significantly lower than that of other groups (P<0.05). These results indicated the MAP solution was more suitable for the low-temperature preservation of canine erythrocyte.

canine; erythrocyte; low-temperature preservation; erythrocyte preservation solutions

2017-03-26 基金项目：天津市“131”创新型人才培养计划第2层次人选资助计划项目

李燕(1991—)，女，贵州遵义人，在读硕士，研究方向为动物细胞工程与繁殖生物技术。丁向彬为通信作者，

E-mail：xiangbinding@163.com

1004-7999(2017)02-0071-05

10.13478/j.cnki.jasyu.2017.02.012

S829.2

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