HMGB1和TNFAIP3在狼疮性肾炎系膜细胞增殖中的作用

张 玮，杨 冉，郭惠芳，封晓娟，魏 群，张 玉，王奕卓，李金泽，刘淑霞

(1. 河北医科大学病理学教研室，河北 石家庄 050017；2.河北医科大学第二医院免疫风湿科，河北 石家庄 050000；3. 河北省人民医院医院感染管理科，河北 石家庄 050000)

HMGB1和TNFAIP3在狼疮性肾炎系膜细胞增殖中的作用

张 玮1，杨 冉1，郭惠芳2，封晓娟1，魏 群3，张 玉2，王奕卓1，李金泽1，刘淑霞1

(1. 河北医科大学病理学教研室，河北 石家庄 050017；2.河北医科大学第二医院免疫风湿科，河北 石家庄 050000；3. 河北省人民医院医院感染管理科，河北 石家庄 050000)

目的 初步探讨高迁移率族蛋白1(high mobility group protein B1，HMGB1)和肿瘤坏死因子α诱导蛋白3(tumor necrosis factor α-induced protein-3, TNFAIP3)在狼疮性肾炎(lupus nephritis，LN)患者和人类肾小球系膜细胞(human mesangial cell, HMC)增殖中的作用及机制。方法 收集Ⅳ型LN患者的肾穿样本，采用免疫荧光和免疫组化技术检测肾小球细胞中HMGB1、TNFAIP3及IκBα蛋白表达水平；运用人重组HMGB1为刺激物刺激HMC，采用BrdU参入技术检测细胞增殖水平，并用Western blot技术检测TNFAIP3、IκBα及p65表达水平。结果 与对照组相比，LN患者肾小球细胞中HMGB1及TNFAIP3蛋白表达升高，IκBα表达水平降低；体外实验证实，人重组HMGB1刺激HMC后，细胞增殖水平明显升高，同时在HMGB1刺激30 min后，与对照组相比，TNFAIP3的蛋白表达水平明显升高(P<0.05)，而IκBα蛋白表达水平降低(P<0.05)，随后p65蛋白表达明显升高(P<0.05)。结论 HMGB1和TNFAIP3可能通过活化NF-κB信号通路促进LN系膜细胞的过度增殖。

狼疮性肾炎；HMGB1；TNFAIP3；细胞增殖；人系膜细胞；蛋白表达

狼疮性肾炎(lupus nephritis，LN)是系统性红斑狼疮常见并发症之一，也是其主要的致死原因，其在国内的发病率逐年攀升，但因具体作用机制并不清楚，治愈率很低[1]。因此，对其作用机制的研究尤为重要。

高迁移率族蛋白1(high mobility group protein B1， HMGB1)是一种非组蛋白染色质结合蛋白，参与DNA的转录及修饰等生物学功能。新近研究发现，HMGB1作为炎症因子参与了呼吸系统、肝脏、肿瘤及自身免疫性疾病如类风湿性关节炎、干燥综合征等多种疾病的发生[2-4]，其在系统性红斑狼疮中的作用也得到越来越多的重视[5]，但HMGB1在LN中发挥了何种作用尚不明确。

之前我们的研究发现在小鼠系膜细胞中，HMGB1能够活化NF-κB信号通路，从而促进系膜细胞的增殖[6]，但在LN患者及人类系膜细胞中是否也存在相似作用仍是未知。此外，我们近来研究发现，在LN患者外周血中肿瘤坏死因子-α-诱导蛋白- 3(tumor necrosis factor α-induced protein 3，TNFAIP3)mRNA表达水平明显升高。TNFAIP3作为炎症反应负向调节的关键分子，是一种表达于多个免疫器官的诱导性胞质蛋白，该基因既具有泛素化酶又具有去泛素化酶的功能[7]，以往研究发现其表达水平异常可能与NF-κB的功能异常有关。然而，TNFAIP3是否与HMGB1共同参与调控NF-κB的活性，从而参与LN的发生发展目前仍不清楚。

因此，本实验拟以Ⅳ型LN患者及人肾小球系膜细胞(human mesangial cell, HMC)为研究对象，通过对HMGB1及TNFAIP3相关信号通路的研究，探讨HMGB1和TNFAIP3在LN肾小球系膜细胞过度增殖中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 采用癌旁远端正常组织和LN患者肾组织各15例，实验已经过伦理委员会核准，由河北医科大学第二医院提供。人系膜细胞系购自中南大学高等研究中心。兔抗HMGB1单克隆抗体(Abcam公司，货号ab79823)，兔抗TNFAIP3多克隆抗体(ABclonal公司，货号A2127)，兔抗IkBα单克隆抗体(Abcam公司，货号ab32518)，兔抗p65多克隆抗体(Abcam公司，货号ab90532)，SP法免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司，货号SP9001)，Dylight 649-山羊抗兔荧光二抗(KPL公司，货号072051806)，BrdU参入试剂盒(Merck Millipore 公司，货号2752)。

1.2 分组 肾穿样本分为正常组织对照组和LN患者组。细胞分组：采用人重组HMGB1蛋白刺激HMC细胞，对细胞增殖水平影响的研究分为空白对照组和不同浓度刺激组，收集不同浓度刺激后各个时间点的细胞；对蛋白表达水平影响的研究分为空白对照组和不同时间点刺激组。

1.3 免疫组化 肾组织脱蜡至水；3%过氧化氢避光孵育20 min，0.01 mmol·L-1枸橼酸修复液，高压修复5 min并自然晾凉；正常山羊血清37℃封闭60 min；滴加抗TNFAIP3或IκBα抗体(1 ∶200稀释)4℃过夜；二抗37℃孵育30 min；三抗37℃孵育30 min；DAB显色液显色5 min；苏木精染色2 min；氨水返蓝30 s，盐酸酒精分化30 s；脱水透明，中性树胶封片。

1.4 免疫荧光 肾组织脱蜡至水；0.01 mmol·L-1枸橼酸修复液，高压修复5 min；正常山羊血清37℃封闭60 min；滴加抗HMGB1抗体(1 ∶200稀释)，4℃过夜；0.01 mmol·L-1PBS洗涤3次，每次5 min；TRITC-山羊抗兔IgG(1 ∶200稀释)37℃孵育60 min(避光)；DAPI复染；荧光显微镜下观察结果。免疫荧光染色结果判定：HMGB1蛋白阳性信号均呈红色荧光。

1.5 BrdU参入法检测细胞增殖水平 HMC细胞以1×105/孔接种于96孔板，用50、100、200μg·L-1的人重组HMGB1蛋白刺激细胞，每组设立3个复孔。37℃、5% CO2孵箱中培养2、4、8、12 h；收集细胞前1 h，每孔加入100 μL BrdU参入液；收集细胞，每孔加入固定液200 μL，室温孵育30 min；Washing Buffer冲洗3次；每孔滴加抗BrdU抗体100 μL，室温放置1 h，Washing Buffer冲洗3次；每孔滴加二抗100 μL，室温孵育30 min，Washing Buffer冲洗3次,滴加过氧化物酶底物每孔100 μL，室温孵育30 min，此时增殖活跃的细胞孔呈蓝色。每孔加入终止液100 μL，细胞孔由蓝色变为亮黄，酶标仪于450 nm处检测其OD值。

1.6 Western blot 采用100 μg·L-1人重组HMGB1蛋白刺激HMC，收集刺激后0、10、20、30、40、50、60 min各时间点的细胞，裂解后，采用BCA试剂盒进行蛋白定量，煮沸5 min变性。50 μg样品进行10% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白分离后湿转至PVDF膜。5%脱脂奶粉37℃封闭1 h。加入TNFAIP3、IκBα或p65抗体(稀释浓度均为1 ∶1 000)4℃孵育过夜。辣根过氧化物酶标记的二抗(稀释浓度为1 ∶5 000)37℃孵育2 h。Odyssey FC成像系统显影，并对条带进行定量分析，以目的条带和β-actin条带积分光密度值(IOD值)的比值代表目的蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 肾组织中HMGB1、TNFAIP3和IκBα蛋白的表达水平 免疫荧光结果提示，与对照组癌旁远端正常组织相比，LN患者肾小球HMGB1蛋白(红色)阳性细胞比例明显升高，且主要定位于细胞核(Fig 1A、1B)。免疫组化结果提示，与对照组相比，TNFAIP3蛋白表达水平升高(Fig 1C、1D)，IκBα蛋白表达水平降低(Fig 1E、1F)，二者均定位于细胞质。

Fig 1 HMGB1, TNFAIP3 and IκBα expression levels in glomerular cells of type Ⅳ LN patients and normal tissues by immunofluorescence and immunohistochemistry technique

A～B:Immunofluorescence of HMGB1 expression; C～D:Immunohistochemistry of TNFAIP3 expression; E～F:Immunohistochemistry of IκBα expression

2.2 HMGB1对HMC细胞增殖的影响 LN患者体内存在HMGB1的上调，该上调是否与细胞增殖有关呢？我们进一步采用HMGB1重组蛋白对人类的系膜细胞(HMC)进行刺激，BrdU参入结果提示，与对照组相比，100、200 μg·L-1HMGB1刺激HMC 8、12 h后，HMC增殖水平均明显升高(P<0.05)，二者之间无明显差异(Fig 2)。

2.3 TNFAIP3在HMGB1参与的NF-κB信号通路中的作用 是否由于HMGB1的上调引起TNFAIP3表达量的变化，从而影响了NF-κB信号通路的活化水平呢？我们采用HMGB1重组蛋白对HMC在不同时间点进行刺激，研究TNFAIP3的表达情况。结果显示，与对照组相比，人重组HMGB1刺激10 min后，HMC中TNFAIP3蛋白表达水平明显增加(P<0.05)，见Fig 3。而IκBα蛋白表达水平与TNFAIP3正好相反，与对照组相比，人重组HMGB1刺激30 min后， HMC中 IκBα蛋白表达明显降低(P<0.05)，见Fig 4。p65蛋白表达水平与IκBα相反，与对照组相比，刺激40 min后，明显升高(P<0.05)。提示TNFAIP3可能参与HMGB1诱导的HMC中NF-κB信号通路的活化，从而促进细胞增殖。

Fig 2 HMC proliferation levels increased significantly after HMGB1 stimulation using BrdU incorporation technology

*P<0.05vscontrol

Fig 3 TNFAIP3 protein expression level increased 10, 20, 30 min after HMGB1 stimulation

*P<0.05vscontrol

3 讨论

LN是系统性红斑狼疮最常见、最严重的并发症，但其发病机制尚未清楚。细胞免疫及体液免疫功能紊乱导致多种细胞因子分泌失衡，并通过相互协同或拮抗作用参与多种组织和器官的损伤[8]，其中HMGB1的作用得到越来越多的关注。HMGB1是一种非组蛋白染色质结合蛋白，我们的前期实验证实了HMGB1在小鼠狼疮性肾炎中异常表达[6,9]，提示HMGB1可能参与了LN的发病过程，但是具体机制如何仍不十分清楚。

Fig 4 IκBα protein expression level decreased,while p65 increased significantly 30 min and 40 min after HMGB1 stimulation

*P<0.05vscontrol

肾小球细胞的增殖是LN的主要病理特征之一，也是其肾脏病理的活动性指标。我们以往研究发现，在小鼠系膜细胞中HMGB1可能促进肾小球细胞增殖，参与疾病发生[6,10]。本研究也证实了HMGB1在LN患者肾小球细胞中，尤其是系膜区细胞中存在表达水平的上调；体外实验则证实了人重组HMGB1能够诱导HMC增殖水平的升高。这些结果提示HMGB1可能在LN的发病过程中发挥了重要作用，而这一作用是通过促增殖作用实现的。那么，HMGB1又是如何发挥作用的呢？

HMGB1可能是通过激活细胞内信号通路发挥其功能的。其中，NF-κB信号通路与免疫性疾病的关系最为密切[11-12]。正常情况下，NF-κB与IκB组成三聚体处于失活状态。IκB蛋白的降解使NF-κB从三聚体中得以释放，并被转移至细胞核中发挥其核转录因子作用。在这个过程中，IκBα的降解是整个信号通路的中心环节之一。在本研究中，我们证实了在LN患者肾小球细胞胞质内确实存在着IκBα蛋白表达水平的降低，提示IκBα有可能遭到降解，泛素化是常见的蛋白降解途径之一。我们对多种泛素连接酶进行了筛选，结果发现TNFAIP3在LN患者中表达水平明显升高。TNFAIP3是一种表达于多个免疫器官的诱导性胞质蛋白，该基因既具有泛素化酶又具有去泛素化酶的功能，因而在免疫调节、抑制肿瘤、TNF介导的细胞凋亡等方面均具有重要作用[7]。有研究证实其与NF-κB-IκB三聚体的关系密切[13]，能够抑制NF-κB的活化，是重要的炎症抑制因子，而且TNFAIP3与风湿性关节炎等多种自身免疫性疾病的关系也十分密切[14]。但是TNFAIP3在LN进展中的作用仍不十分明了，我们在研究中发现，与对照组相比，TNFAIP3在LN患者肾小球中的表达出现上调，推测TNFAIP3表达水平的变化可能是由HMGB1所介导的。

因此，我们以人重组的HMGB1刺激HMC，结果发现TNFAIP3表达水平迅速升高，随后我们检测到了IκBα蛋白表达水平的下调，p65蛋白表达水平明显增加。以上实验结果均提示，HMGB1可能通过上调TNFAIP3蛋白表达水平，影响IκBα的表达水平，诱发NF-κB信号通路的活化，介导系膜细胞过度增殖，从而参与LN的发病。以往研究认为TNFAIP3为NF-κB的负调节因子[15]，但是在LN中TNFAIP3的具体作用尚不明确，因此，是否有其他的因素影响其负调控作用仍是未知[16]。总之，TNFAIP3是如何影响IκBα表达水平，其具体作用机制有待进一步研究。

综上所述，本研究证实了HMGB1和TNFAIP3在LN肾小球系膜细胞过度增殖中的重要作用，为揭示LN的发病过程提供了新的依据，同时为其靶向治疗提供了新的思路。

(致谢:本实验在河北省肾脏病重点实验室、河北医科大学病理实验室完成，特此致谢! )

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Role of HMGB1 and TNFAIP3 involved in mesangial cell proliferation of lupus nephritis

ZHANG Wei1, YANG Ran1,GUO Hui-fang2,FENG Xiao-juan1,WEI Qun3,ZHANG Yu2,WANG Yi-zhuo1, LI Jin-ze1, LIU Shu-xia1
(1.DeptofPathology,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China;2.DeptofRheumatology,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China;3.DeptofNosocomialInfectionControl,HebeiGeneralHospital,Shijiazhuang050000,China)

Aim To investigate the mechanism of high mobility group protein B1(HMGB1) and tumor necrosis factor α-induced protein-3(TNFAIP3) involved in cell proliferation in lupus nephritis(LN) patients and human mesangial cells(HMC).Methods Immunofluorescence and immunohistochemistry technique were employed to detect HMGB1, TNFAIP3 and IκBα expression levels in glomerular cells of type Ⅳ LN patients. BrdU incorporation technology was used to detect cell proliferation level in HMC after stimulated by recombinant HMGB1.TNFAIP3 and IκBα expression levels in HMC were detected after HMGB1 stimulation by Western blot.Results The expression levels of HMGB1 and TNFAIP3 were increased in LN patients, while IκBα was decreased. HMC proliferation levels increased significantly after HMGB1 stimulation. At the same time, 30 minutes after HMGB1 stimulation, the expression level of TNFAIP3 was significantly increased(P<0.05), while IκBα decreased(P<0.05) and then p65 increased significantly(P<0.05),compared with control group.Conclusion HMGB1 and TNFAIP3 are probably involved in mesangial cell proliferation by activating of NF-κB signaling pathways in LN pathogenesis.

lupus nephritis; HMGB1; TNFAIP3; cell proliferation; human mesangial cells; protein expression

2017-03-18,

2017-04-16

河北省自然科学基金青年基金资助项目(No H2015206449)；河北省卫生厅重点科技研究计划(No ZD20140034)；河北省大学生创新创业训练计划(No 201510089038)

张 玮(1983-)，女，博士，讲师，研究方向：泛素化与去泛素化在狼疮性肾炎发病中的作用，E-mail：zwbl201309@126.com； 杨 冉(1990-)，女，硕士生，研究方向：狼疮性肾炎的发病机制，共同第一作者，E-mail：767388259@qq.com； 刘淑霞(1975-)，女，博士，教授，研究方向：狼疮性肾炎的发病机制，通讯作者，E-mail: susanliu1976@163.com

时间：2017-7-7 11:04 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170707.1104.028.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.08.014

A

1001-1978(2017)08-1109-05

R322.61；R329.24；R593.242；R977.6