直流微电场对钛种植体骨结合影响的初步研究

韩 巍 高羽萱 王潇宇 刘 娜 李鸿波

直流微电场对钛种植体骨结合影响的初步研究

韩 巍 高羽萱 王潇宇 刘 娜 李鸿波

目的：初步探究直流微电场对钛种植体骨结合的影响。方法：建立大鼠胫骨种植体模型，加载直流微电场，4周或8周后分别进行种植体周围骨密度的测量，扭矩值的测定，硬组织磨片的分析。结果：实验组种植体接触率明显高于对照组，实验组骨小梁间隔明显低于对照组(P＜0.05)。第4周及第8周实验组大鼠种植体的平均旋出扭矩值均明显高于对照组(P＜0.05)。第4周实验组大鼠种植体骨结合率明显高于对照组，种植体周骨小梁面积百分数升高明显(P＜0.05)。组织学结果显示：加载电场后，骨组织向种植体表面延伸生长，高倍镜下可见其形态类似于“伪足”。直流微电场组其标本钙化及未完全钙化骨组织密集，与种植体的附着密度大，骨质致密，且骨质成熟度高，而对照组种植体周围骨组织稀疏，新生骨小梁间隔明显偏大，小梁间的网格状结构明显不如实验组密集，骨成熟度及与种植体的粘附程度均稍差。结论：直流微电场可增强SD大鼠胫骨种植体周骨密度，促进骨结合。

动物实验；种植体；骨结合；直流微电场

种植体修复术日益成为修复牙缺失、牙列缺损的主流治疗方式之一[1]。种植体-骨整合过程与骨折的愈合类似，良好的骨整合是种植治疗成功的先决条件[2]。骨髓间充质干细胞(BMSCs)是形成种植体-骨界面骨整合的种子细胞[3]。提高BMSCs在骨整合过程中的迁移速率和成骨能力是研究的热点，目前常用的方法主要有改变种植体表面形态、物理因素及化学因素的刺激等[4，5]。骨是天然的良导体，外源性电场可以促进骨折的愈合[6]。目前有研究表明电容螯合电场可促进犬牙槽骨骨折愈合及兔胫骨种植体植入后的骨愈合[7]。我课题组先前细胞实验结果显示：直流微电场可促进体外培养的骨髓间充质干细胞迁移、增殖及分化成骨，并筛选出最适电场强度及最佳作用时间(4小时，200mv/mm)[8]。直流微电场对活体动物植入物与骨结合的影响，目前尚未见报道。因此本研究拟利用大鼠种植体模型探究直流微电场对胫骨植入物-骨结合的影响

1.材料及方法

1.1 实验对象及材料 SPF级雄性SD大鼠(购自北京维通利华实验动物公司)，重量150-180g。所有的动物护理程序及动物使用方式均通过中国人民解放军总医院伦理委员会审查。主要实验材料见表1。

表1 实验材料

1.2 构建大鼠胫骨种植体模型 将80只6周龄的SD大鼠随机分为两组，全身麻醉，于膝关节下1cm处沿肢体长轴内侧切开，分离肌肉、筋膜及骨膜，充分暴露骨面。术野为一平缓的三角形骨面，保证各只大鼠均在同一位置植入，用TR12金刚砂车针备洞，洞深2mm。旋入种植体，配合剪切扭力计测量扭矩，使种植体旋入扭矩均维持15N，冲洗手术部位，缝合肌层及皮肤，种植体顶帽部分暴露。手术后第二天加载直流微电场，将阳极特制铜片卡固定于种植体顶帽，在平行于顶帽的对侧放置由高分子塑料特制的阴极卡托(内嵌铜片)，固定，测量阴阳极铜片间的距离，连接可调电容器。实验组每天加载4小时，场强维持在200m v/mm，加载14天，对照组做空白对照手术后无其它处理。

1.3 种植体周骨密度测定 分别于种植术后的第4周及第8周，各取实验组及对照组大鼠5只，颈椎脱臼法处死，取含有种植体的完整胫骨，固定。利用M icro CT仪测量种植体周围骨组织的密度。随后将各组标本分别固定于钳夹工作台上，种植体顶帽连接剪切扭力计，在扭力计的施力端逐渐加力，直至种植体松动，读取数值，该数值为种植体骨界面间的剪切强度。

1.4 种植体周围形态计量学、组织形态学观察于种植术后的第4周，各取实验组及对照组大鼠5只，颈椎脱臼法处死，取材，甲醛固定30分钟，在浓度梯度分别为70%、90%、100%的乙醇和氯仿溶液中分别依次进行浸泡脱水。后将标本依次置于处理液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中浸泡，4℃，2天，随后在37℃下二步法包埋(古莎7200树脂包埋液)，将包埋后的标本粘附于盖玻片上，利用磨片机修整标本，暴露种植体-骨界面，抛光打磨，将另一盖玻片粘附于组织面上，切片机切割出100-200μm厚的切片。磨片机依次以800目、1200目砂纸将组织片研磨至30μm厚，最后用4000目砂纸抛光，亚甲基蓝-酸性品红法染色。光学显微镜下观察。应用Image-Pro Plus 6.0数字化图像分析系统进行骨组织计量学分析。

相关计量公式：种植体骨结合率=种植体与髓腔内钙化骨基质接触的总长度/髓腔内种植体外形轮廓的总长度×100%；种植体周围骨小梁面积百分数=种植体周围0.2mm内骨小梁总面积/种植体周围0.2mm内的区域总面积×100%。

2.结果

2.1 构建SD大鼠胫骨种植体模型 种植手术严格遵循无菌操作的原则，所有标本均建模成功，植入后的大鼠生长良好，无死亡。术后第二天X线片示种植位置准确，无较大偏移，见图1。

图1 大鼠胫骨种植体模型

2.2 胫骨种植体周骨密度测定 对M icro-CT测量结果进行统计学分析。种植体植入后4周，实验组种植体-骨体积分数(骨体积/总体积)及骨小梁的厚度均明显高于对照组(P＜0.05)，且相比于对照组骨小梁间隔降低明显，骨小梁数目升高(P＜0.05)，骨小梁间隔小表示骨密度较高。结果见表2，图2。

表2 Micro-CT胫骨种植区域两个不同组第4周的参数比较(Mean±SD)

图2 第4周M icro CT三维重建图

2.3 旋出种植体扭矩值测定 分别对第4周及第8周标本进行种植体旋出扭矩值测定，结果显示加载直流微电场的实验组平均旋出扭矩明显高于未加载直流微电场的对照组组(P＜0.05)。结果见表3。

表3 大鼠胫骨种植体旋出扭矩值(N·cm)(Mean±SD)

2.4 种植体形态计量学分析 由Image-Pro Plus 6.0数字化图像分析系统分别测量两组实验标本的种植体与髓腔内钙化骨基质接触的总长度，髓腔内种植体外形轮廓的总长度，种植体周围0.2mm内骨小梁总面积及种植体周围0.2mm内的区域总面积的相对数值。结果显示：第4周实验组标本种植体骨结合率明显高于对照组标本(P<0.05)；且实验组标本的种植体周围骨小梁面积百分数明显增高(P<0.01)，结果见表4。

表4 第4周大鼠胫骨种植体骨结合率和大鼠胫骨种植体周骨小梁面积百分数(Mean±SD)

2.5 种植体组织形态学观察 对所获两组样本切片进行组织形态学观察，结果显示：直流微电场组种植体周围骨组织向种植体表面延伸生长，高倍镜下可见其形态类似于“伪足”。直流微电场组其标本钙化及未完全钙化骨组织密集，与种植体的附着密度大，骨质致密，且骨质成熟度高，而对照组种植体周围骨组织稀疏，新生骨小梁间隔明显偏大，小梁间的网格状结构明显不如实验组密集，骨成熟度及与种植体的粘附程度均稍差(见图3)。

图3 大鼠胫骨术后第4周种植体周组织形态

3.讨论

本实验发现加载直流微电场后种植体周围骨小梁厚度及种植体周围骨密度均明显增加，直流微电场的加载可促进类骨基质的合成及分泌，使矿物质的沉积及钙化速率明显加快，种植体-骨界面骨质生成速度及成熟度明显高于未加载直流微电场组。从而证实直流微电场可以促进种植体-骨界面的骨整合，可以缩短种植体植入后的愈合时间。种植体-骨界面的结合过程类似于骨折的一般愈合过程[9，10]。有动物实验研究发现，以大鼠为动物模型的骨折愈合在受到外源性电场刺激后其骨折的愈合速度明显加快，血痂改建期明显缩短，证明外源性电场可有效促进骨愈合[11]。另有研究发现，电容鳌合电场可以有效促进钛植入物与狗胫骨骨整合的速度[12]。但是目前对于直流微电场促进种植体骨结合的动物实验却鲜有报道，本实验在前期细胞实验的基础上通过动物实验进一步证实了直流微电场对种植体骨结合的促进作用。

本实验采用第4周及第8周种植体旋出扭矩值评价种植体-骨整合的效果。有研究证实糖尿病大鼠胫骨钛植入物第4周旋出扭矩明显低于正常大鼠胫骨钛植入物旋出扭矩值[13]。另有实验证实，兔胫骨种植体在第4周至第8周平均旋出扭矩值明显发生改变[14]。虽然上述实验和本实验研究方向及种植体类型均有差异，但利用第4周及第8周旋出扭矩值得测定作为评价指标是可行的、可靠的。本实验中直流微电场加载组该项指标明显高于未加载直流电场的对照组，说明直流微电场作为一种物理刺激因素促进种植体-骨界面的骨整合是行之有效的。

综上所述，直流微电场可以增强大鼠胫骨种植体周骨密度，促进骨与植入物结合强度，因此，我们证实了直流微电场可以提高种植体骨结合的能力。

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A prelim inary study on the effect of DCEF on osseointegration of titanium imp lants

HAN Wei,GAO Yu-xuan,WANG Xiao-yu,LIU Na,LI Hong-bo
(Department of Stomatology,Chinese PLA General Hospital,Beijing 100853,China)

Objective:To investigate the effect of direct current electric field(DCEF)on the osteointegration of titanium implants.M ethods:Put the implants into the rat tibias.After 4 or 8 weeks of DCEF loading,the bone m ineral density, implants rotation torque values and hard tissue grinding analysis of the experimental groups and the control groups were measured.Results:The bone-implant contact rates of the experimental groups were significantly higher than those of the control groups,and the trabecular spaces in the experimental groups were significantly lower than those in the control groups(P＜0.05).The average rotational torque values of the experimental groups were significantly higher than those of the control groups in the 4th and 8th week(P＜0.05).In the 4th week,the osseointegration rate of the implants in the experimental group was significantly higher than that in the control group,and the percentage of trabecular bone area of the implants increased significantly(P＜0.05).The histological results showed that:A fter loaded DCEF,the bone around the implants extended to the implants surface and formed a pseudopod-like structure.The experimental groups were more closely adherent to the implants surface than the control groups.There were a large number of new trabecularbone and bone-like matrix on the surface of the implants.The trabecular bone was connected w ith each other into a net-like structure. The implant-bone interface in the experimental groups had uniform new bone.In the control groups,new bone tissues were loose,bone tissues maturity and the degree of tightness of the implant-bone were less.Conclusion:DCEF can enhance the implant-bone density of SD rat tibia,promote osteointegration.

animal experiment;implant;osseointegration;direct current electric field

R783

A

1672-2973(2017)03-0166-04

2017-01-30)

军队十二五课题(项目编号：CWS12J134)解放军总医院转化医学项目(项目编号：2016TM-022)

韩 巍 解放军总医院口腔修复科 硕士生 北京 100853

王潇宇 解放军306医院口腔科 医师 北京 100853

高羽萱 解放军总医院口腔科 医师 北京 100853

刘 娜 解放军总医院口腔科 主治医师 北京 100853

李鸿波 通讯作者 解放军总医院口腔修复科 主任医师 教授 北京 1000853