电针延缓HepG2裸鼠荷瘤生长趋势及对PCNA表达影响

王睿,余陈欢,方杰,曹畅

(1.杭州市中医院,杭州 310007;2.浙江省医学科学院,杭州 310007)

电针延缓HepG2裸鼠荷瘤生长趋势及对PCNA表达影响

王睿1,余陈欢2,方杰2,曹畅1

(1.杭州市中医院,杭州 310007;2.浙江省医学科学院,杭州 310007)

目的观察电针干预对HepG2裸鼠荷瘤生长趋势及PCNA表达的影响。方法将32只裸鼠随机分为电针组、电刺激组、模型组与空白组,每组8只。采用HepG2建立皮下荷瘤裸鼠模型。电针组采用双下肢足三里十三阴交穴进行电针干预,电刺激组取相同穴位进行直接电流刺激。观测荷瘤体积变化、瘤重比和肿瘤生长抑制率,并检测荷瘤组织PCNA的表达水平。结果电针组、电刺激组和模型组干预前后荷瘤体积比较,差异均无统计学意义(P＞0.05);电针组、电刺激组干预后荷瘤体积与模型组比较,差异均无统计学意义(P＞0.05),但电针组荷瘤体积生长趋势较缓。各组干预前后裸鼠体重比较,差异均无统计学意义(P＞0.05)。电针组干预后瘤重比与电刺激组和模型组比较,差异均有统计学意义(P＜0.05);但电刺激组干预后瘤重比与模型组比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。电针组干预后肿瘤生长抑制率与电刺激组比较,差异有统计学意义(P＜0.05)。电针组和电刺激组干预后PCNA表达水平与模型组比较,差异均有统计学意义(P＜0.05);但电针组干预后PCNA表达水平与电刺激组比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。结论电针干预在一定程度上可延缓HepG2荷瘤生长趋势。

电针;电刺激;HepG2荷瘤;PCNA;裸鼠

目前我国恶性肿瘤的疾病负担日益严重,发病率和死亡率均呈逐年上升趋势[1-2],并给患者带来巨大的经济压力[3]。随着2006年世界卫生组织提出肿瘤是一种慢性的可控性疾病[4],“带瘤生存”的理念逐渐被广泛接受[5-6]。经过有效的抗肿瘤治疗后,病情相对稳定,但不再接受或耐受放化疗和手术的癌症患者和老年患者,都是针灸发挥调控效应的切入点和优势所在[7-8]。本研究运用 PCNA作为可观评价指标,探讨电针对HepG2裸鼠荷瘤的生长是否有正向调控作用,为将针灸运用到临床“带瘤生存”提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

SPF级BALB/C(nu/nu)裸鼠32只,雌雄各半,体重16～20g,4～5周龄。由浙江省医学科学院动物实验中心负责调剂[动物生产许可证号SCXK(沪)2013-0016],常规饲养。实验前将裸鼠常规适应性喂养1星期,对所有裸鼠称重,使用剪趾方法编号。按体重的顺序排列,采用随机数字法分为电针组、电刺激组、模型组和空白组4组,每组8只。

1.2 主要试剂与仪器

1.2.1 主要试剂

DMEM粉、RPMI1640培养液(Sigma中国),苏木素染液、伊红染液(国药集团化学试剂有限公司),PCNA组化试剂盒(谷歌生物),组化试剂盒 DAB显色剂(DAKO)。

1.2.2 主要仪器

RM2016病理切片机、KD-P组织摊片机(金华市益迪医疗设备),Eclipse Ti-SR倒置荧光显微镜、DS-U3成像系统(日本尼康),DL-5M高速冷冻离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司),GT1001组化笔(Gene tech)。

1.3 动物模型制备

首先将HepG2细胞置于含10%PBS的DMEM细胞培养液中进行培养和传代,选择对数生长期细胞,使用RPMI1640培养液配制为2×107/mL细胞。分别在电针组、电刺激组和模型组裸鼠右前肢腋窝下,接种浓度为2×107/mL的 HepG2细胞悬液0.2mL(含活细胞5×106/0.2mL)。接种细胞后每日定时观察裸鼠细胞接种部位的成瘤情况[9]。所有裸鼠均在皮下种植肿瘤细胞后1星期即可触及瘤块生长。

1.4 干预方法

电针组取双侧下肢足三里十三阴交,穴位定位及操作依据《实验针灸学》[10]。采用小鼠固定器十双腿胶布固定的方法进行捆绑,电针操作选用苏州医疗用品厂有限公司出品的0.18mm×10mm美容用毫针进行针刺,然后接华佗牌电针仪(型号 SDZ-Ⅱ),电针仪频率选择2/100 Hz疏密波,电流强度从0.1 mA开始逐渐加强,根据裸鼠耐受情况,以身体开始扭动和嘶叫为度。

电刺激组使用相同方式的固定,采用电极直接刺激双侧足三里和三阴交位,电流强度、频率等同电针组。

模型组和空白组均使用相同方式的固定,不予其他特殊处理。

各组均每日干预1次,每次干预30min,连续治疗10次。

1.5 观察指标

1.5.1 荷瘤体积变化

裸鼠接种肿瘤细胞后密切观察荷瘤生长情况。等裸鼠荷瘤肉眼可见后,于干预开始第2、5、8天与实验结束第2天使用电子游标卡尺测量荷瘤的长径(a)、短径(b),分别计算肿瘤体积(V)、相对肿瘤体积(RTV)和相对肿瘤增殖率(T/C)[11]。

1.5.2 瘤重比和肿瘤生长抑制率

实验结束第2天将裸鼠称重后,颈椎脱臼处死各组裸鼠,完整剥离肿瘤,去除血污、脂肪等非肿瘤组织,称取瘤体重量,计算瘤重比和肿瘤生长抑制率[12]。

1.5.3 荷瘤组织的PNCA免疫组化

细胞增殖能力的评价采用荷瘤组织的 PNCA免疫组化检测。在每组内随机挑选3个切片,每张切片随机挑选3个200倍视野进行拍照,合计9个视野。应用Image-Pro Plus6.0软件选取相同的棕黄色作为判断所有照片阳性的统一标准,对每张照片进行分析得出每张照片阳性的累积光密度值(IOD值)[13]。

1.6 统计学方法

所有数据采用SPSS16.0进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示,如符合正态分布,采用方差分析(one-way ANOVA);如不符合正态分布,采用非参数检验(Mann-Whitney U)。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 电针对裸鼠荷瘤体积变化的影响

由表1可见,干预前后各组荷瘤体积比较,差异均无统计学意义(P＞0.05)。干预后计算RTV值,模型组为(2.61±0.61),电针组为(2.28±1.11),电刺激组为(3.42±1.63);计算T/C(%)值,以模型组为100%,电针组为(146±93)%,电刺激组为(89±42)%,各组间比较差异均无统计学意义(P＞0.05)。从干预前到干预后,各时间点荷瘤体积绘制成的折线趋势图(见图2)可大致看出电针组裸鼠荷瘤生长速度较其余两组相对缓慢。

表1 各组各时间段裸鼠瘤体积比较 (±s,mm3)

表1 各组各时间段裸鼠瘤体积比较 (±s,mm3)

注:与同组治疗前比较1)P＜0.05;与对照组比较2)P＜0.05

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图1 各组各时间点荷瘤体积折线趋势图

2.2 电针对荷瘤裸鼠瘤重比和肿瘤生长抑制率的影响

表2 各组平均瘤重、瘤重比和肿瘤生长抑制率比较(n=8)(±s)

表2 各组平均瘤重、瘤重比和肿瘤生长抑制率比较(n=8)(±s)

注:与模型组比较1)P＜0.05;与电刺激组比较2)P＜0.05

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由表2及图2可见,各组干预前后裸鼠体重比较,差异均无统计学意义(P＞0.05)。干预后计算瘤重比,电针组优于电刺激组和模型组,差异均具有统计学意义(P＜0.05),但电刺激组和模型组间比较差异无统计学意义(P＞0.05);计算肿瘤生长抑制率后显示,电针组肿瘤生长抑制率与电刺激组比较,差异具有统计学意义(P＜0.05)。

图2 各组干预前后裸鼠体重比较

2.3 荷瘤组织PCNA表达比较

由图3可见,红圈所示棕黄色为PCNA阳性表达的细胞,与模型组比较,电针组与电刺激组均对裸鼠肿瘤组织PCNA表达有一定的下调作用,差异具有统计学意义(P＜0.05),但电针组与电刺激组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。详见表3。

表3 各组荷瘤PCNA免疫组化IOD值比较 (±s)

表3 各组荷瘤PCNA免疫组化IOD值比较 (±s)

注:与模型组比较1)P＜0.05

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图3 荷瘤组织PCNA表达(×200)

3 讨论

带瘤生存的目的是经有效治疗后,肿瘤病灶可处于相对静止状态,人体与肿瘤“长期共存”。运用针灸的优势不在于直接杀伤肿瘤细胞,而是通过作用于肿瘤生长的内在环境,纠正机体失衡状态,提高整体免疫功能,达到控瘤生存目的[14-16]。补其不足,泻其有余,恢复阴平阳秘的状态,是中医学控瘤的基本原则。尤其中晚期和老年恶性肿瘤患者正处于正邪俱伤或正气已虚、不耐攻伐的阶段,为实现带瘤生存,更需重视脾胃正气的培补[17-18]。《千金翼方》:“腹中积聚,皆针胞门。”《针灸甲乙经》:“胞中有大疝瘕积聚……补尺泽、太溪、手阳明寸口。”上文均描述了针灸通过扶正驱邪和疏通经络的作用达到治瘤目的。针灸立足于对整体功能的调节,不产生毒副反应,搭配其他治疗方法,能起到减毒增效的作用,使其在古往今来肿瘤攻克中占有一席之地[19-20]。

针灸作为“中医基础理论”指导下开展应用的学科,使用足三里十三阴交表里经配穴法,以扶正固本、培补脾胃和调和阴阳为治疗原则。足三里是足阳明胃经的下合穴,是健脾和胃、补益后天之要穴,可调节脾胃的运化功能。三阴交是足太阴脾经的腧穴,主治脾胃虚弱,有健脾益气、温中补虚之功效。《灵枢·根结》:“用针之要,在于知调阴和阳。”阐明了针灸治疗疾病具有调和阴阳的作用。足阳明胃经的足三里和足太阴脾经的三阴交穴配伍,能发挥阴阳经腧穴间的协同作用,调节机体阴阳平衡。既往研究证实,针灸可通过改善肿瘤免疫功能[21-22]或者调整生物节律[23],发挥抗肿瘤和改善患者生存质量的作用,还具有经济、安全和操作简便等优势。因此,针灸对肿瘤调控的临床价值是可以作为带瘤生存期的维持手段,长期运用于临床,不会给患者家庭带来过重的经济负担[24-27]。

本研究设置电刺激组作为对照,运用同样的电针仪和刺激强度,把电极直接贴敷在相同穴位的皮肤上进行干预,目的是尽可能排除电流刺激本身对荷瘤裸鼠作用的影响,可更精确地观测腧穴针刺效应[28-29]。并运用增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)评价肿瘤细胞增殖状态,其是在细胞周期 S期广泛表达的一种核蛋白,阳性表达说明细胞正处于增殖期[30-33]。综合分析瘤重比和干预前到干预后荷瘤体积增长趋势等结果,并考虑到电针组PCNA呈下调表达,说明电针可以通过相关通路影响到肿瘤细胞的增殖,初步认为电针具有一定的延缓荷瘤生长趋势作用。但目前仅能证明在HegG2癌细胞株上,还需要选择不同的肿瘤细胞株进行研究。并且本研究观测得到的生长趋势有延缓变化的结果,仅体现在实施干预的这一段时间里,在将来的研究中,需对针灸后效应和电针对荷瘤裸鼠生存时间的影响进行深入探讨。本研究后续还将对电针组与模型组间差异表达的microRNA进行筛选工作,运用基因芯片技术更好地探索电针控瘤机制。

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Electroacupuncture Delaying Tumor Growth and its Effect on PCNA Expression in HepG2 Nude Mice

WANG Rui1, YU Chen-huan2, FANG J ie2, CAO Chang1. 1.Hangzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine,Hangzhou 310007,China;2.Zhejiang Academy of Medical Science,Hangzhou 310007,China

ObjectiveTo explore the effect of electroacupuncture intervention on tumor growth and PCNA expression in HepG2 nude mice.MethodsThirty-two nude mice were randomized to electroacupuncture,electrostimulation, model and blank control groups,8 mice each. A nude mouse model of subcutaneous tumor was made with HepG2. The electroacupuncture group

electroacupuncture at points Zusanli and Sanyinjiao on bilateral lower limbs and the electrostimulation group, direct electrical stimulation of the same points. The tumor volume, the tumor/weight ratio and the tumor growth inhibition rate were observed. PCNA expression in the tumor tissue was determined.ResultsThere was no statistically significant pre-/post-intervention difference in the tumor volume in the electroacupuncture, electrostimulation and model groups (P＞0.05). There was no statistically significant post-intervention difference in the tumor volume between the electroacupuncture or electrostimulation group and the model group (P＞0.05), but tumor growth tended to slow in the electroacupuncture group. There was no statistically significant pre-/post-intervention difference in the nude mouse weight in every group (P＞0.05). There was a statistically significant post-intervention difference in the tumor/weight ratio between the electroacupuncture group and the electrostimulation or model group (P＜0.05), but no statistically significant post-intervention difference in the tumor/weight ratio between the electrostimulation and model groups (P＞0.05). There was a statistically significantpost-intervention difference in the tumor growth inhibition rate between the electroacupuncture and electrostimulation groups (P＜0.05). There was a statistically significant post-intervention difference in the PCNA expression level between the electroacupuncture or electrostimulation group and the model group (P＜0.05), no statistically significant post-intervention difference in the PCNA expression level between the electroacupuncture and electrostimulation groups (P＞0.05).ConclusionElectroacupuncture can delay HepG2 tumor growth to a certain extent.

Electroacupuncture; Electrostimulation; HepG2 tumor; PCNA; Nude mice

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2017.07.0852

1005-0957(2017)07-0852-05

2017-03-12

浙江省中医药科技计划项目(2015ZA161);浙江省院所专项(2015D3006)

王睿(1987—),男,主治医师,博士,Email:k444www@163.com

余陈欢(1982—),男,副研究员,博士,Email:yuchenhuan2002@163.com