音乐电针对急性脑出血大鼠灶周铁离子、神经元细胞凋亡百分率和脑组织含水量的影响

徐春兰,王凡,东红升

(1.上海中医药大学,上海201203;2.上海市针灸经络研究所,上海 200030)

音乐电针对急性脑出血大鼠灶周铁离子、神经元细胞凋亡百分率和脑组织含水量的影响

徐春兰1,王凡1,东红升2

(1.上海中医药大学,上海201203;2.上海市针灸经络研究所,上海 200030)

目的观察音乐电针对急性脑出血大鼠脑内灶周铁离子变化、神经元细胞凋亡和脑组织含水量变化的影响,探讨音乐电针对急性脑出血的作用机制。方法将128只健康成年雄性Wistar大鼠随机分为正常组、模型组、电针组和音乐电针组,每组分为6h、24h、3d、7d 4个时间点,每个时间点8只。应用胶原酶法制备急性脑出血大鼠模型。电针组和音乐电针组正极接百会穴,负极接太阳穴,选择参数为2 V,通电时间为30min。于造模后6h、24h、3d、7d 4个时间点观测脑内灶周铁离子变化的水平、灶周神经元细胞凋亡及脑组织含水量的变化。结果造模后6h、24h、3d、7d,模型组、电针组、音乐电针组大鼠脑内铁离子含量、神经元细胞凋亡均高于正常组(P＜0.05),24h、3d、7d时电针组、音乐电针组均低于模型组(P＜0.05),3d、7d时音乐电针组低于电针组(P＜0.05)。造模后6h、24h、3d、7d,模型组、电针组、音乐电针组大鼠脑组织含水量均高于正常组(P＜0.05),3d时电针组、音乐电针组均低于模型组(P＜0.05),7d时音乐电针组低于电针组(P＜0.05)。结论音乐电针对急性脑出血大鼠脑内灶周铁离子有良性调节作用,抑制脑出血后早期血肿周围部位神经元细胞凋亡的发生,减轻脑水肿,疗效优于电针组。

电针;脑出血;铁离子;神经元细胞;大鼠

脑出血是常见的脑血管疾病,占卒中的20%～30%,具有高发病率、高致残率的特点,给家庭和社会带来重大负担。近年研究发现,脑出血后红细胞裂解,释放的血红蛋白及其降解产物铁离子,在介导脑出血后氧化损伤和细胞凋亡在继发性脑损伤机制中起着重要的作用[1]。本研究以脑出血大鼠为模型,探讨音乐电针对急性脑出血大鼠脑内灶周铁离子、神经元细胞影响,具体方法如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

128只健康成年雄性Wistar大鼠,体重为250～300g,清洁级。由上海中国科技院实验动物有限公司提供(合格证号SCXK沪2007-0002)。饲养于上海中医药大学附属岳阳医院实验动物中心普通饲养室,人工光照,光暗各12h,45%左右相对湿度,自由饮食,饲料由上海必凯公司提供,适应性饲养1星期。大鼠随机分成正常组、模型组、电针组、音乐电针组,每组分为6h、24h、3d、7d 4个时间点,每个时间点8只。

1.2 主要试剂和仪器

1.2.1 主要试剂

胶原酶Ⅶ(Sigma America);肝素(江苏江山生化制药有限公司);水合氯醛(中国医药集团上海化学试剂公司)。

1.2.2 主要仪器

动物头颅立体定位仪(深圳瑞沃德生命科技有限公司,单臂脑立体定位仪/8001);微量进样器(上海高欣玻璃仪器);牙科钻头(北京医疗设备厂);IMS细胞图像分析系统医学图像分析软件(上海申腾信息技术有限公司);显微镜(OLYMPUS BH2);数码相机(NI KON仪器);切片机(RM2145,Lico,德国);凝胶成像分析系统(Chemi Imager5500,Alpha Innotech,美国);组织匀浆机(UP 200s,DR Hielscher,德国);恒温水浴箱(1070,FEL,德国);LSRⅡ型流式细胞仪(BD公司);华佗牌针灸针(苏州医疗用品厂);音乐电针仪2J-12H(哈尔滨福恩堂医疗器械有限公司)。

1.3 造模方法

参照任泽光等[2]的方法,大鼠10%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔麻醉后,俯卧位固定于脑立体定位仪,调节门齿托的高度,使动物的前、后齿处于同一水平。头顶备皮后,局部皮肤采用碘伏消毒,在头顶部约前囟所在位置纵向剪一长10mm的窗口,剥离骨膜,以前囟为坐标原点,向前0.48mm,向右 3mm,确定注射点坐标,用牙科钻钻直径约1.0mm圆孔直达骨膜,穿透颅骨但不伤及脑组织(按Pellegrio图谱B坐标系定位右尾核,A 0.48～0.5;R 2.6～3.4;H 5.0～7.0)。用微量注射器吸取含0.25u/μL胶原酶的生理盐水和6.25u/μL肝素的生理盐水各10μL,沿钻孔处竖直、缓慢进针6.0mm,缓慢匀速注射5min后,留针10min,缓慢退针2～3min,切口处撒少许青霉素粉防止局部感染,缝合皮肤,放回笼内观察、饲养。造模后的动物在自然苏醒后,参照Zea-Longa的5级评分标准[3],对其神经障碍进行评分。0级,无神经功能丧失;1级,右前肢不能充分伸展;2级,向右环形运动,轻度局灶神经功能缺失;3级,向右侧倒,中度局灶神经功能缺失;4级,不能自然行走,重度局灶神经功能缺失。只有神经功能障碍在1级(含)以上的存活大鼠才能入组。

1.4 治疗方法

参照《实验针灸学》[4],大鼠百会穴定位于大鼠头顶两耳根连线与前后中线交点。太阳定位于外眼角与耳之间的凹陷中。常规消毒,以0.25mm× 25mm毫针,分别刺入百会(向右前太阳穴方向)和太阳(右侧)穴。电针组将正极接百会穴毫针,负极接太阳穴毫针,选择参数为2 V、15 Hz,连续波,通电时间为30min。音乐电针组将2J-12H型音乐脉冲治疗仪正极接百会穴,负极接太阳穴,选择参数为2V,选中风治疗单元乐曲声波,通电时间为30min。6h组为造模后6h针刺1次后取材检测,24h为造模后24h针刺1次后取材检测,3d、7d为造模后每日针刺1次。

1.5 样本取材处理

治疗结束后,颈椎脱臼方法处死大鼠。然后用剪刀迅速沿着枕骨大孔处剪断颈椎,用止血钳迅速剥离颅骨,将大脑取出,取注射部位脑组织后部,平均分为两份,放置在冻存管中,低温保存。用于铁离子含量测定和流式阳性细胞百分率测定。

1.6 观察指标

1.6.1 铁离子含量测定

取脑组织加入浓硝酸5mL(16mol/L)和高氯酸0.5mL(12mol/L),加热消化至清亮,用原子吸收光谱法测定。

1.6.2 流式阳性细胞百分率测定

AnnexinV检测(磷脂酞丝氨酸外翻分析)。组织加入PBS匀浆,离心收集(1500r/min,5min)细胞;PBS洗两遍;重悬于200μL Binding Buffer(结合液)中使细胞终浓度为2×105～1×105个/mL;加荧光标记的AnnexinV-FITC10μL和5μL PI混匀,加入300μL Binding Buffer;流式细胞仪检测观测结果。采用488nm激发,其检测波长分别是527nm和590nm。

1.6.3 脑组织含水量测定

大鼠麻醉下,断头处死,处死后迅速提取脑作冠状全脑切片(定位切片发现注射部位在右侧尾状核),取含注射部位脑组织前部做脑含水量测定。立即用薄层刀片取血肿周围组织,称湿重后将脑组织块放入干燥箱中100℃烘烤24h后,再称干重。按干湿重法测定脑水含量,以脑水含量代表脑水肿的程度。

计算公式为脑组织水含量=[(湿重－干重)/湿重]×100%。

1.7 统计学方法

所有数据用SPSS18.0统计软件进行统计学分析,计量资料以均数±标准差表示,组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用q检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠脑内灶周铁离子比较

造模后6h、24h、3d、7d,模型组、电针组、音乐电针组与正常组大鼠脑内灶周铁离子比较,差异有统计学意义(P＜0.05);电针组、音乐电针组与模型组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。在造模后24h、3d、7d,电针组、音乐电针组大鼠脑内灶周铁离子含量均低于模型组,差异有统计学意义(P＜0.05)。造模后 3d、7d,音乐电针组大鼠脑内灶周铁离子含量低于电针组,差异有统计学意义(P＜0.05)。说明针刺能降低脑出血大鼠脑内灶周铁离子含量,减轻水肿。详见表1。

表1 各组大鼠脑内灶周铁离子比较 (±s,mg/kg)

表1 各组大鼠脑内灶周铁离子比较 (±s,mg/kg)

注:与正常组比较1)P＜0.05;与模型组比较2)P＜0.05;与电针组比较3)P＜0.05

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2.2 不同时间点各组大鼠脑组织形态学观察

造模后在各个时间点模型组较正常组可见大量白细胞浸润,有胶质细胞聚集现象,而电针组、音乐电针组白细胞及胶质细胞聚集较模型组少,音乐电针组较电针组更少。详见图1。

图1 不同时间点各组急性脑出血大鼠TUNEL染色图片(×200)

2.3 各组大鼠脑内神经元细胞凋亡百分率比较

造模后6h、24h、3d、7d,模型组、电针组、音乐电针组与正常组大鼠脑内神经元细胞凋亡百分率比较,差异有统计学意义(P＜0.05);6h时电针组、音乐电针组与模型组比较无显著性差异(P＞0.05)。24h、3d时电针组、音乐电针组大鼠脑内神经元细胞凋亡百分率与模型组比较,均低于模型组,有统计学差异(P＜0.05),电针组与音乐电针组比较无统计学差异(P＞0.05);7d时电针组、音乐电针组大鼠脑内神经元细胞凋亡百分率与模型组比较,均低于模型组,有统计学差异(P＜0.05),音乐电针组低于电针组,比较有统计学差异(P＜0.05)。详见表2。

表2 各组大鼠脑内神经元细胞凋亡百分率比较 (±s,%)

表2 各组大鼠脑内神经元细胞凋亡百分率比较 (±s,%)

注:与正常组比较1)P＜0.05;与模型组比较2)P＜0.05;与电针组比较3)P＜0.05

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2.4 各组大鼠脑组织含水量比较

造模后6h、24h、3d、7d,模型组、电针组、音乐电针组大鼠脑组织含水量与正常组比较有统计学差异(P＜0.05);电针组、音乐电针组与模型组比较无统计学差异(P＞0.05)。3d时电针组、音乐电针组大鼠脑组织含水量与模型组比较,均低于模型组,有统计学差异(P＜0.05),电针组与音乐电针组比较无统计学差异(P＞0.05);7d时电针组、音乐电针组大鼠脑组织含水量与模型组比较,均低于模型组,有统计学差异(P＜0.05),音乐电针组低于电针组,比较有统计学差异(P＜0.05)。详见表3。

表3 各组大鼠脑组织含水量比较 (±s,%)

表3 各组大鼠脑组织含水量比较 (±s,%)

注:与正常组比较1)P＜0.05;与模型组比较2)P＜0.05;与电针组比较3)P＜0.05

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3 讨论

脑出血后,血肿中心被血肿本身占位性损害,局部脑组织血液循环障碍,造成缺血缺氧。而随着出血时间延长,出血增多,可能造成神经元生存环境的破坏,血中神经毒性物质加剧了神经元的损伤。有研究发现,脑血肿中具有很高神经毒性作用的血红蛋白,导致脂质过氧化作用反应及自由基的形成[5]。在大鼠脑出血后,脑脊液内的自由铁浓度增加,至少 28d后过多的铁才能被清除[6］。神经元凋亡的重要触发因素之一可能是血肿吸收过程中释放的血红素和铁离子[7]。在脑出血过程中铁总浓度的增加,会导致神经元细胞严重的毒性损伤。脑水肿是脑出血较早被发现的继发性神经损伤之一,脑水肿的程度及持续时间与脑出血的预后密切相关。大鼠脑出血后脑内直接注射铁离子可以直接引起脑水肿而铁离子螯合剂能减轻水肿,说明铁离子在脑出血水肿的形成中具有重要的作用[8]。铁离子螯合剂可以通过降低血红蛋白诱导的组织型转谷氨酰胺酶的表达,减少脑出血后脑细胞发生神经退行性变[9]。

本研究结果显示,脑出血后,针刺可降低脑内铁离子含量,降低脑组织水肿,减少脑神经元细胞的凋亡,电针组、音乐电针组脑内铁离子含量、脑内凋亡细胞百分率及脑组织含水量均显著低于模型组(P＜0.05),说明脑出血后早期铁离子浓度升高导致血肿周围部位细胞凋亡发生,而电针能下调铁离子含量,减轻脑水肿,减少神经元细胞凋亡。

本研究结果也表明,脑出血后,音乐电针组脑内铁离子含量、脑内含水量及脑内凋亡细胞百分率在7d均显著低于电针组(P＜0.05),说明音乐电针疗效优于普通电针。中国古代将声音分为角、徵、宫、商、羽五个音阶,以此为基础,音乐的调式分为五种,不同调式的音乐具有不同的感染力,产生不同的音乐效果。音乐电针疗法是将音乐疗法、音乐电流和电针疗法结合起来治疗疾病的方法[10],使患者在机体和心理上获得双重的治疗效果[11]。《黄帝内经》提出五音疗疾的方法根据五种调式与五脏、五志的关系选曲编排治疗[12]。据中国传统五音疗法理论,探索不同音乐元素、音乐电流与脏腑、经络、器官相关的现代理论依据,从而扩展音乐范围和临床应用范围,为患者提供更加有效的治疗方法[13]。音乐电针结合音乐与针刺疗法,其将特定的音频信号同步转化为频率多变的脉冲电流,克服了传统电针长时间单一频率刺激所致的腧穴耐受性及不敏感性的现象[14-17]。音乐电针还能维持神经纤维的兴奋性,易产生持久针感,以最大程度维持治疗效果,减少治疗周期[18-21]。

综上所述,电针组和音乐电针组对急性脑出血大鼠脑内铁离子有调节作用,改善脑内微环境的变化,减轻脑水肿,阻止神经元细胞凋亡的影响[22-25],本研究也表明,音乐电针疗效优于普通电针,原因可能是音乐电针克服了长时间刺激后引起腧穴耐受性和不敏感性[26-29]。

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Effect of Music Electroacupuncture on Perifocal Ferric Ions and Neuronal Apoptosis Percentage and the Brain Water Content in Rats with Acute Cerebral Hemorrhage

XU C hun-lan1, WANG F an1, DONG Ho ng-sheng2.1.Shanghai University of T raditional Ch inese Med icine,Shanghai 201203,China;2.Shanghai Resea rch Institute of Acupuncture and Meridian,Shanghai 200030,China

ObjectiveTo investigate the effect of music electroacupuncture on perifocal ferric ions and neuronal apoptosis and the brain water content in rats with acute cerebral hemorrhage and explore the mechanism of its action on acute cerebral hemorrhage.MethodsOne hundred and twenty-eight healthy adult male Wister rats were randomized to normal, model, electroacupuncture and music electroacupuncture groups. In each group, four time points of 6 hrs,24 hrs,3 days and 7 days were set up, eight rats each time point. A rat model of acute cerebral hemorrhage was made using collagenase. In the electroacupuncture and music electroacupuncture groups, point Baihui was connected to the anode and point Taiyang to the cathode,2 voltage was used as a selection parameter and electroacupuncture lasted 30min. Intracerebral perifocal ferric ions and neuronal apoptosis and the brain water content were measured at four time points of 6 hrs,24 hrs,3 days and 7 days after model making.ResultsIntracerebral ferric ion content was higher in the model, electroacupuncture and music electroacupuncture groups of rats than in the normal group at 6 hrsafter model making (P＜0.05), lower in the electroacupuncture and music electroacupuncture groups than in the model group at 24 hrs,3 and 7 days after model making (P＜0.05) and lower in the music electroacupuncture group than in the electroacupuncture group at 3 and 7 days after model making (P＜0.05). Intracerebral neuronal apoptosis was higher in the model, electroacupuncture and music electroacupuncture groups of rats than in the normal group at 6 hrs after model making (P＜0.05) and lower in the music electroacupuncture group than in the electroacupuncture group at 7 days after model making (P＜0.05). The brain water content was higher in the model, electrocupuncture and music electroacupuncture groups of rats than in the normal group at 6 and 24 hrs after model making(P＜0.05), lower in the electroacupuncture and music electroacupuncture groups than in the model group at 3 days after model making (P＜0.05) and lower in the music electroacupuncture group than in the electroacupuncture group at 7 days after model making (P＜0.05).Conclusions Music electroacupuncture has a benign regulating effect on intracerebral perifocal ferric ions, inhibits neuronal apoptosis around hematoma in the early stage and reduces cerebral edema in rats with acute cerebral hemorrhage. Its therapeutic effect is superior to that of electroacupuncture.

Music electroacupuncture; Cerebral hemorrhage; Ferric ion; Neuron; Rat

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2017.07.0840

1005-0957(2017)07-0840-06

2016-10-21

国家自然科学基金项目(30500677)

徐春兰(1989—),女,2013级硕士生,Email:xuchunlan23@126.com

东红升(1971—),男,副研究员,博士,Email:dhsdoctor2005@126.com