体外扩增源于成人头皮组织的真皮细胞具有多向分化潜能

周倩，张群，冷雪，俎廷建，秦静，温洁，吴训伟,2（通讯作者）

（1.山东大学口腔医院，山东 济南 250000；2. 山东大学苏州研究院，江苏 苏州 215000）

体外扩增源于成人头皮组织的真皮细胞具有多向分化潜能

周倩1，张群1，冷雪1，俎廷建1，秦静1，温洁1，吴训伟1,2（通讯作者）

（1.山东大学口腔医院，山东 济南 250000；2. 山东大学苏州研究院，江苏 苏州 215000）

目的 探讨来源于成人头皮组织的真皮细胞经体外培养扩增后其向成脂、神经、成骨及成肌方向分化的潜能，为皮肤创伤修复种子细胞的新来源提供依据。方法 取胚胎及成人头皮组织分离真皮细胞。利用维持细胞多功能性的培养基传代培养，取第4代真皮细胞免疫荧光染色，通过检测 波形蛋白和角蛋白的表达进行细胞鉴定。对真皮细胞进行定向分化诱导并用免疫荧光染色检测各方向分化指标蛋白，通过和源于胚胎头皮组织的真皮细胞比较，来分析其多向分化潜能。结果 原代细胞分离后24h贴壁，细胞形态多为梭形或多角形，可多次传代且传代后细胞形态均一稳定。免疫荧光染色结果显示该细胞仅表达波形蛋白（vimentin）不表达角质蛋白（Pan-CK）；源于成人及胚胎头皮的真皮细胞均能诱导向成脂、成骨、成神经及成肌细胞方向分化，尽管与源于胚胎组织的细胞相比，成人真皮细胞分化效率相对较低。结论 源于头皮分离的成人真皮细胞经培养扩增后能诱导分化成不同组织细胞，因而具有多向分化潜能。由于成人头皮组织相对容易获得，其来源广泛，因而可成为皮肤组织工程研究以及临床应用的理想种子细胞。

成人皮肤组织；真皮细胞；波形蛋白；角蛋白；多向分化

0 引言

真皮细胞来源于胚胎中胚层间质细胞，具有增殖能力强、体外培养不易老化、易于传代的特点，是人体分布最广，参与组织修复最重要的一类细胞，被视为人体数量最大的“种子细胞库”[1]。以往的研究认为，真皮细胞是终末分化细胞，不具备继续向其他细胞方向分化潜能，而且，体外培养扩增的细胞往往丧失其多功能性。但是，近期有报道称真皮细胞在特定的诱导条件下，可以向成骨、成软骨、成脂、成胰岛方向分化[2-5]。能够表达间充质干细胞相关标志物CD71、CD73/SH3-SH4、CD90/Thy-1、CD105/SH2 和CD16/ALCAM[6-8]，通过病毒转导相关转录因子到胚胎成纤维细胞诱导其多功能性，成纤维细胞能够表达多功能性标志蛋白SSEA1、SOX2和NANOG等[9]。值得一提的是，郭常敏[3]对人的包皮细胞进行诱导后，可向成脂、成骨及成软骨方向分化，但未报道向成神经及成肌方向的分化；Lee[10]等研究中，将神经相关因子转入人真皮细胞中，发现转染细胞表达神经相关蛋白及神经胶质细胞表面标志，证实相关神经因子的诱导分化功能，而真皮细胞自身分化潜能未知。这些报道主要是来自较年轻的包皮组织来源的真皮细胞的研究，而对成人组织真皮细胞研究较少。毛发组织一直被认为是分离高潜能干细胞的来源，因为毛囊中存在干细胞niche,另外毛乳头细胞和毛囊真皮间鞘细胞具有多向分化潜能，然而毛囊来源的干细胞分离方法较繁琐，而且得到细胞数也较少。本课题组已成功创建分离和培养皮肤多功能细胞体系，利用该体系培养的来源胚胎头皮细胞移植到免疫鼠身上能再生带有附属器官的完整人类皮肤，表明培养扩增后细胞仍具有再生能力。为进一步探讨成人皮肤组织来源细胞的多功能性，本文以成人的头皮组织来源的真皮细胞作为研究对象，利用我们创建的简便分离方法分离并培养扩增[11]，对传代扩增后的真皮细胞进行多向诱导分化，并与胚胎细胞进行比较，来鉴定成人真皮细胞成脂、成骨、成神经及成肌多向分化潜能，为将来组织工程学种子细胞的来源提供依据。

1 真皮细胞的分离与传代

取人头皮组织，70%乙醇消毒1-3min ,浸泡于含2%双抗的PBS液中，手术刀刮除脂肪及血渍，PBS冲洗皮肤2次。混合法[11]分离细胞，接种于培养皿中，37℃，5%CO2及饱和湿度条件下培养。3天后换液，去除未贴壁细胞。每5天换液1次，当细胞融合至80%～90%时，进行传代。取第4代细胞用于研究。

2 真皮细胞的体外定向诱导分化

取两种来源的第3代真皮细胞，0.05%胰酶消化，细胞重悬。每种诱导方式均同时将两种来源细胞分别接种到含灭菌盖玻片的24孔板中，制备细胞爬片。接种细胞数为5×104-8.0×104个/孔，每种细胞设8个复孔，待细胞完全融合，取其中两个孔做阴性对照组，另外六孔作为实验组加入相应的诱导液进行培养（不同诱导液成分见表1）。均放置于37℃、5% CO2及饱和湿度条件下静置培养。

2.1 成脂诱导及鉴定

细胞完全融合后，弃掉培养液，阴性对照组用正常培养基培养，实验组用成脂诱导液诱导培养两周，每3天换一次液，37oC、5% CO2及饱和湿度条件下静置培养。两周后进行免疫荧光染色，标记FABP-4蛋白的表达。

2.2 成骨诱导及鉴定

细胞完全融合后，弃掉培养液，阴性对照组用正常培养基培养，实验组每孔加入500μL诱导液进行诱导培养。此后，每隔3天更换成骨诱导液1次，分化诱导3周后，免疫荧光染色标记骨桥蛋白（Osteopontin）的表达。

2.3 成肌分化诱导及鉴定

细胞完全融合后，弃掉培养液，阴性对照组用正常培养基培养，实验组每孔加入500μL成肌诱导液，诱导48h后换为普通培养基。每3-4天换1次液，分化诱导2周后，免疫荧光染色检测钙调蛋白（Calponin）的表达。

2.4 向神经细胞分化诱导及鉴定

取第3代真皮细胞，胰酶消化后，将5×104个细胞接种于24孔板中，制备细胞爬片。当细胞达到80%融合时加入诱导液进行诱导，3周后分别检测神经元及神经胶质细胞特异表达蛋白p75NTR和GFAP的表达。

表1 诱导液成分

3 免疫荧光染色检测分化指标

诱导分化后，弃掉培养基，PBS冲洗3次，4%多聚甲醛固定15min , PBS冲洗3次，5%BSA封闭1h，取出爬片，滴加一抗（Anti-CalponinRabbitmAb，ab46794，abcam，1∶250；Anti-OsteopontinMouse mAb，ab69498，abcam；2 μg/ml；FABP4 (D25B3) XPRabbit mAb，#3544S，CST，1：200；GFAP (GA5) Mouse mAb，#3678S，CST，1：300；p75NTR (D4B3) XPRabbit mAb，#8238S，CST，1：1600；Pan-CK，Mouse mAb，BD Biosciences，Cat：550951，1：500）4℃孵育过夜，荧光二抗（Dylight 594 Goat Anti-Mouse IgG（H+L），GAM5942，联科生物，1：1000; Dylight 488 Goat Anti-Rabbit IgG（H+L），GAR4882，联科生物，1：1000）室温避光孵育1h，封片，镜下观察拍照。

4 结果

4.1 细胞形态及生长特点

具有多向分化潜能的原代真皮细胞为贴壁生长的长梭型细胞，分离后24h贴壁，呈多角形集落样生长，刚贴壁时体积小，类似圆形，3天后，体积变大，呈多角形，胞质丰富，胞核清晰。传代后，细胞形态规则均一，呈长梭型，生长密度达70%左右时增殖明显（图1）。

图1 第4代真皮细胞（×100）

4.2 Vimentin及Pan-CK的表达

免疫荧光法检测原代真皮细胞特异性标志物vimentin的表达为阳性，Pan-CK为阴性（图2）

图2 第4代真皮细胞（×100）

4.3 分化诱导

源于胚胎及成人头皮的真皮细胞向成骨方向诱导1周后开始出现钙盐及钙化结节，并随诱导时间的加长而增多，诱导3周左右，特异性标志蛋白骨桥蛋白（Osteopontin）染色呈阳性（图3A，B），结果显示胚胎组诱导效率高于成人组；在成脂诱导中，细胞体积随诱导时间加长逐渐变大，1周左右出现脂滴，并逐渐增多，诱导3周时进行免疫荧光染色，FABP-4蛋白呈阳性表达（图4A，B），结果显示胚胎组FABP-4蛋白阳性表达率高于成人组；成神经分化诱导3周后，用免疫荧光染色法分别标记神经元及神经胶质细胞的标志性蛋白p75NTR和GFAP，胚胎组p75NTR和GFAP分别呈阳性，而成人组p75NTR表达不明显，GFAP表达呈阳性，且表达强度高于胚胎组（图5A，B，C，D）；成肌诱导第3周后，两组细胞钙调蛋白（Calponin）均呈阳性表达（图6A，B）。

图3 真皮细胞成骨诱导（免疫荧光染色，×100）

图4 真皮细胞成脂诱导（免疫荧光染色，×100）

图5 真皮细胞成神经诱导（免疫荧光染色，×100）

图6 真皮细胞成肌诱导分化（免疫荧光染色，×100）

5 讨论

再生医学是利用人体的潜能，给其创造一个再生生理环境和激活因素，而后利用自身条件启动再生程序。再生医学涉及身体的各个器官的再生修复，皮肤再生是其中一种，对于大面积烧伤或者其他皮肤疾病需要皮肤移植治疗的临床疾病，提供种子细胞是组织再生的根本，通过体外培养扩增种子细胞，再生或重建组织来修复受损器官。作为种子细胞，至少具有以下两个特性即容易获得和培养扩增后保持多向分化潜能。通常情况下，皮肤组织容易得到，但是经体外培养的细胞往往丧失其多向分化能力而达不到再生相应组织的能力，所以，体外培养细胞的干性维持在皮肤再生过程中极其关键。以往研究显示皮肤来源的祖细胞（SKP）具有多向分化潜能，然而SKP分离培养方法比较复杂，需要一定时间来扩增。毛囊组织周围存在干细胞群包括毛乳头细胞，从毛囊组织分离的干细胞在体外具有很强的分化潜能，因而比来源于皮肤其他部分更具有优越性。然而传统的显微解剖法分离毛囊来源的干细胞如毛乳头，分离劳动强度大而且得到细胞较少等缺陷。本团队创建了分离皮肤组织的简单方法，分离的胚胎头皮细胞经培养扩增后，移植到体内能再生带有毛发等附属器官的完整皮肤[11]，建议我们体外培养扩增的胚胎细胞具有多向分化潜能，然而胚胎组织在临床上不可能来源于自体细胞，加上伦理问题以及成瘤的可能性，而限制其应用。本文选择具有毛囊的成人头皮组织作为研究对象，分离头皮组织的真皮细胞，并经传代培养扩增后来研究其是否和源于胚胎组织细胞一样，具有多向分化潜能。

首先，利用本实验室细胞创建的分离培养体系[11，15]，分离后的真皮细胞24h贴壁，初期，细胞呈圆形，贴壁4到5天传代后，细胞形态均匀稳定，变大变饱满，成偏长的三角形。免疫荧光染色标记间充质细胞的特异性表达蛋白vimentin 呈阳性，而表皮细胞特异表达标志蛋白Pan-CK表达为阴性，说明分离出的细胞为真皮细胞，未有表皮细胞污染。以往的分离方法大多数是利用两步酶消化法[12，13]，本实验结合传统的细胞分离方法，改良为一步法，能简单有效地从成人皮肤组织分离表皮和真皮细胞[15]。然后，分离的细胞进行培养扩增和传代，取第4代的真皮细胞进行分化诱导，免疫染色分化指标显示来自成人头皮组织真皮细胞不仅能向成脂、成肌、成骨方向分化，并且能分化成神经元及神经胶质细胞。 与胚胎头皮的真皮细胞相比，尽管诱导分化效率相对较低，但来源于成人组织的真皮细胞具有很强的多向分化潜能。比较不同发育时期真皮细胞分化潜能的差异性，显示：这种培养体系下两种来源的真皮细胞均具有多向分化潜能，Junker等人已经证实，真皮成纤维细胞具有向成脂、成肌、成骨及成软骨方向分化的潜能，但向神经细胞的分化能力报道较少，而且成人组织来源的细胞也研究较少[2-3，6-9，14，16]。本研究比较全面的显示来源成人头皮组织真皮成纤维细胞能向不同胚层包括外胚层的神经细胞分化。该结果我们分离培养体系能培养扩增多向分化潜能的皮肤真皮细胞。 考虑到胚胎来源细胞的伦理性及成人来源皮肤的广泛性，成人组织来源的皮肤细胞实用价值更高，可作为皮肤再生基础研究和自体细胞移植治疗皮肤创伤成为的种子细胞。

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Culture-expanded adult dermal cells derived from scalp tissue are multi- differentiation potential

ZHOU Qian1, ZHANG Qun1, LENG Xue1,ZU Ting-jian1,QING Jing1, WEN Jie1, WU Xun-wei1,2
(1.Stomatological Hospital of Shandong University, Jinan, 250000;2. Su Zhou research institute of Shandong University Suzhou, 215000)

Objective The study was to explore that he potential of culture-expanded dermal cells derivedfrom adult scalp tissue in vitro differentiating into adipoblasts, nerve, osteoblasts and myofibroblasts, and it would provide a basis for the new source of seed cells for skin wound repair. Methods The dermal cells derived from adult and embryonic scalp tissues were respectively isolated and cultured in the media that could maintain cell multipotential. After 4th passage, the dermal cells were identified by detecting the expression of vimentin and pan-CK b y immunofluorescence staining. Thedirectional differentiation of dermal cells was induced by different conditioned media and the difference of multi-differentiation potential between adult and embryonic dermal cells was analyzed with detecting the expression of differentiation markers by immunofluorescence staining. Results The primary cells completely attached to the culture-dish within 24h after isolation and the cell shapes were irregular, most of which were spindle or polygonal shape. The cellular morphology became uniform after passages. Theimmunofluorescent staining results showed that these cells expressed mensenchymal marker vimentin, but didn’t express epidermal cell marker pan-CK . After cultured in inducing differentiation medium, both adult and embryonic cells were able to differentiate into osteoblasts, adipoblasts, nerveand myofibroblasts, although that the differentiation efficiency of adult dermal cell wass relatively lower compared to that of embryonic cells. Conclusion The adult dermal cells after culture-expanded in vitro were able to differentiate into different cell types and could maintain multi-differential potential. The adult issues are easy to access and obtain, therefore our results suggest the adult dermal cells are the ideal source cells for both basic research and clinical application in the field of skin tissue engineering and regeneration.

Embryo Adult； Dermal cell； vimentin； keratin； Multi-directional differentiation

10.19335/j.cnki.2096-1219.2017.03.01

苏州市科技计划项目（ZXY201441），江苏省科技计划项目（BK20161241）

周倩，女，硕士研究生；山东大学口腔医院，助理工程师。研究方向：毛发再生新技术。吴训伟，男，研究员，博导；山东大学口腔医院；研究方向：皮肤和毛发再生新技术及其应用研究。