肥皂水对狂犬病病毒灭活作用的研究

刘淑清 王茜 李艳荣 陶晓燕 于鹏程 卢学新 吴未辰 闫江弘 朱武洋

102206 北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 卫生部医学病毒和病毒病重点实验室

·论著·

肥皂水对狂犬病病毒灭活作用的研究

刘淑清 王茜 李艳荣 陶晓燕 于鹏程 卢学新 吴未辰 闫江弘 朱武洋

102206 北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 卫生部医学病毒和病毒病重点实验室

目的 为考察肥皂水对狂犬病病毒的灭活作用，探讨狂犬病暴露后处置中冲洗伤口推荐使用肥皂水的浓度。方法 用不同浓度肥皂水与狂犬病病毒CVS-11混合作用后，分别感染BSR和N2a细胞，通过直接免疫荧光(DFA)和逆转录PCR(RT-PCR)的方法检测不同浓度肥皂水对狂犬病病毒的灭活效力。结果 在24孔板培养细胞为基础的模型中，确定了BSR和N2a细胞所能承受的肥皂水浓度上限为1.0%；不同浓度肥皂水对狂犬病病毒的灭活试验结果显示，终浓度为0.5%的肥皂水作用BSR或N2a细胞3 min后可完全灭活狂犬病病毒，使其丧失感染细胞的能力，而浓度为0.1%的肥皂水不能完全抑制狂犬病病毒的存活。结论 使用浓度为0.5%～ 1.0%的肥皂水与狂犬病病毒CVS-11混合作用3 min后能使其完全灭活。

Fund programs: National Key Technology Research and Development Project (2016YFC1200905); National Key Technology R&D Program (2014BAI13B04); National Natural Science Foundation of China (31500152); National Key Research Program (2016YFD0500400)

狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies virus)感染引起的一种动物源性传染病。狂犬病病毒主要通过破损的皮肤或粘膜侵入人体，临床大多表现为特异性恐风、恐水、咽肌痉挛、进行性瘫痪等[1,2]。近年来，狂犬病报告死亡数一直位居我国法定报告传染病前列，给人民群众生命健康带来严重威胁[3]。暴露后处置是暴露后预防狂犬病的唯一有效手段。世界卫生组织认为，及时、科学和彻底的暴露后预防处置能够避免狂犬病的发生。狂犬病预防控制工作，尤其是暴露后的预防处置，及时冲洗处理伤口，则能将入侵的病毒全部或大部分消除或杀灭在伤口周围，阻止其扩散，降低狂犬病所致死亡。Kaplan等[4]的研究指出，1%的肥皂水即可在1 min内灭活病毒，但1%以下浓度的肥皂水对狂犬病病毒的灭活效率尚不清楚。鉴于此，本实验首次针对狂犬病暴露后处置中肥皂水浓度建立了N2a和BSR细胞感染模型，并对肥皂水抑制狂犬病病毒存活的效力进行进一步的细胞实验观察。

1 材料与方法

1.1 病毒及细胞 本室制备的狂犬病病毒CVS-11国际标准攻击毒株(1.7×107LD50/ml)；试验用细胞来源：BSR细胞，为仓鼠肾细胞BHK-21的克隆；Neuro-2a(N2a)细胞为小鼠神经瘤细胞, 均为本实验室保存。

1.2 主要试剂及仪器 选取市售的某三种不同品牌的肥皂待用。HyClone改良Eagle细胞培养液(DMEM)和5%胰酶均购自杭州吉诺生物医药技术有限公司；四季青胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；狂犬病病毒核蛋白荧光抗体购自美国Millipore公司；Trizol购自Invitrogen公司；氯仿、异丙醇、无水乙醇、DEPC处理水购自北京卓诚惠生生物技术有限公司，READY TO GO 逆转录试剂盒(Amersham公司)随机引物pd(N)60.2 μg/μl(TaKaRa公司)。倒置显微镜为日本奥林巴斯CXX41型；荧光显微镜为日本奥林巴斯Ⅸ51型。

1.3 BSR和N2a细胞对肥皂水的耐受实验 胰酶消化BSR和N2a为单层细胞，以含10%胎牛血清的DMEM培养液吹打细胞，细胞计数板计数后，每瓶接种2 ×106个细胞，补加培养液，于37 ℃ 5%CO2孵箱孵育。将消化好的BSR和N2a细胞分别加入24孔板，CO2培养箱培养24 h，待细胞密度达到80%左右待用。选取某三种不同品牌的肥皂分别配置不同浓度的肥皂水，在100 ml DMEM中分别添加0.05 g﹑0.1 g﹑0.5 g﹑1 g﹑2 g﹑5 g和10 g的肥皂配置成终浓度为0.05%、0.1%、0.5%、1%、 2%、5%和10%的肥皂水。用500 μl不同浓度的肥皂水作用细胞，观察细胞对肥皂水的耐受力，以确定BSR和N2a细胞所能承受的肥皂水浓度的上限。

1.4 不同浓度肥皂水对狂犬病病毒的灭活试验 将BSR和N2a细胞分别加入24孔板，CO2培养箱培养24 h，待细胞密度达到80%左右待用。将CVS-11病毒液稀释到1.7×105LD50/ml，取100 μl与400 μl不同浓度的肥皂水混合作用3 min[5]，分别接种BSR和N2a细胞。反复冻融三次收集悬液，离心取上清液100 μl与400 μl DMEM培养液混合作用3 min，分别接种BSR和N2a细胞，连续传代3次，DFA测定狂犬病病毒的存活情况。病毒感染组将CVS-11病毒液稀释到1.7×105LD50/ml，取100 μl病毒液与400 μl DMEM培养液混合作用3 min，分别接种BSR和N2a细胞作为阳性对照。

1.5 直接免疫荧光法检测狂犬病病毒 使用直接免疫荧光法(Direct immunofluorescence assay，DFA)在细胞模型中检测病毒的活力，在细胞孔中加入冷丙酮(4 ℃)固定10 min；用PBS振洗2遍，蒸馏水振洗1遍，每次2 min。将稀释好的狂犬荧光抗体(约100 μl左右)加入细胞孔中，装进湿盒，放入37 ℃孵箱中，30 min；用PBS振洗2遍，蒸馏水振洗1遍，每次2 min；荧光显微镜观察。

1.6 RT-PCR法检测狂犬病病毒N基因片段 以RNA提取试剂盒(美国Qiagen公司)提取阳性标本总RNA，经逆转录反应管(Ready-To-Go You-Prime First-Strand Beads)(Amersham公司)试剂盒反转录制备cDNA文库,采用巢式PCR的方法以cDNA文库为模板扩增病毒标本N基因片段。PCR引物序列根据狂犬病病毒N基因(GenBank 号：M13215)序列设计，上游引物为N127(+): 5′-ATGTAACACCTCTACAATGG-3′,下游引物为N8m(-):5′-CAGTCTCYTCNGCCATCT-3′, 进行第一次PCR扩增。预期扩增片段大小为1 533 bp(位于基因全长的第55～1 587位核苷酸)，扩增条件为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s, 56 ℃ 30 s, 72 ℃ 100 s，共35个循环，72 ℃ 10 min。

以第1次PCR反应产物作为第2次PCR反应的模板，第2次PCR反应上游引物为N577(+):5′-AAGATGYGCYAAYTGGAG-3′,下游引物为N829(-)：5′-GCCCTGGTTCGAACATTAT-3′。预期扩增片段大小约为250 bp(位于基因全长的第644-899 位核苷酸)，扩增条件为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 40 s， 72 ℃ 40 s，共35个循环，72 ℃ 10 min。

将巢式二次PCR产物在凝胶成像仪中观察结果。与Marker中250 bp条带平行的位置能观察到明亮的条带，即为阳性结果。PCR扩增阳性样品送北京天一辉远科技有限公司纯化、测序。采用NCBI网站的BLAST在线软件比对所测病毒N基因序列。

2 结果

2.1 肥皂水作用BSR和N2a细胞浓度上限的确定 用500 μl不同浓度的肥皂水作用BSR和N2a细胞48 h，5% 浓度的肥皂水加入细胞后，细胞均完全崩解死亡(图1A，图2A)； 2% 浓度的肥皂水分别加入BSR和N2a细胞后，细胞均出现部分崩解变形(图1B，图2B)；1% 浓度的肥皂水分别作用BSR和N2a细胞后，细胞均形态完整，结构清晰，生长良好(图1C，图2C)，0.05%、0.1%和0.5%浓度的肥皂水分别作用BSR和N2a细胞均与1% 浓度的肥皂水作用效果一致(图略)；并且不同品牌的肥皂分别配置的不同浓度肥皂水作用BSR和N2a两种细胞的耐受实验均一致，说明了肥皂水作用细胞耐受实验的可重复性和有效性。因此，BSR细胞所能承受的肥皂水浓度上限为1%， 后续实验随机选取一种肥皂水配置0.05%～ 1.0% 浓度的肥皂水建立抑制狂犬病病毒CVS-11在BSR和N2a细胞上的感染模型。

注：A：5% 肥皂水对BSR细胞的影响(200×)；B：2% 肥皂水对BSR细胞的影响(200×)；C：1% 肥皂水对BSR细胞的影响(200×)；D：空白BSR细胞对照(200×)图1 不同浓度肥皂水对BSR细胞的影响Note: A: effect of 5% soap solution on BSR cells (200×); B: effect of 2% soap solution on BSR cells (200×); C: effect of 1% soap solution on BSR cells (200×); D: blank BSR cells (200×)Fig.1 Effect of different concentration of soap solution on BSR cells

注：A：5% 肥皂水对N2a细胞的影响(200×)；B：2% 肥皂水对N2a细胞的影响(200×)；C：1% 肥皂水对N2a细胞的影响(200×)；D：空白N2a细胞对照(200×)图2 不同浓度肥皂水对N2a细胞的影响Note: A: effect of 5% soap solution on N2a cells (200×); B: effect of 2% soap solution on N2a cells (200×); C: effect of 1% concentration soap solution on N2a cells (200×); D: blank N2a cells (200×)Fig.2 Effect of different concentrations of soap solutions on N2a cells

2.2 肥皂水对狂犬病病毒的灭活效果分析 分别使用终浓度为0.05%、0.1%、0.5%和1%的肥皂水与狂犬病病毒CVS-11混合作用3 min后，感染BSR和N2a细胞48 h后，反复冻融三次收集悬液，离心取上清液100 μl与400 μl DMEM培养液混合作用3 min，分别接种BSR和N2a细胞，连续传代3次后DFA测定狂犬病病毒细胞的情况。结果表明：病毒感染组能引起明显的细胞病变现象，约有90%(+++)的BSR细胞被狂犬病病毒感染而呈现特异的绿色荧光(图3A)；约有65%(+++)的N2a细胞被感染呈特异的点状绿色荧光(图4A)；浓度为0.05%的肥皂水与CVS-11混合后分别作用细胞，约有35%(++)的BSR细胞(图3B)及30%(++)的N2a细胞(图4B)被狂犬病病毒感染；0.1% 浓度的肥皂水与CVS-11混合后分别作用BSR和N2a细胞，约有5%(+)的细胞被狂犬病病毒感染(图3C，图4C)。浓度为0.5%或1%的肥皂水与CVS-11混合液作用的BSR和N2a细胞均生长状况良好， 荧光显微镜下未观察到特异的绿色荧光(图3D，图4D)，DFA检测结果提示，CVS-11病毒已被完全灭活丧失感染力。因此，终浓度为0.5%的肥皂水作用BSR或N2a细胞3 min后可完全灭活狂犬病毒，使其丧失感染细胞的能力，而0.1% 浓度的肥皂水不能完全抑制狂犬病病毒的存活。

注：A：CVS-11病毒感染组(200×)；B：0.05% 肥皂水与CVS-11混合作用对BSR细胞的影响(200×)C: 0.1% 肥皂水与CVS-11混合作用对BSR细胞的影响(200×)；D：0.5% 肥皂水与CVS-11混合作用对BSR细胞的影响(200×)图3 0.05%～ 1% 肥皂水与CVS-11混合作用对BSR细胞的影响Note: A: CVS-11 infection group(200×); B: the mixture of CVS-11 with 0.05% soap solution effect on BSR cells (200×); C: the mixture of CVS-11 with 0.1% soap solution effect on BSR cells (200×); D: the mixture of CVS-11 with 0.5% soap solution effect on BSR cells (200×)Fig.3 The effect of mixture of 0.05%-1% soap solutions and CVS-11 on BSR cells

注：A：CVS-11病毒感染组(200×)；B：0.05% 肥皂水与CVS-11混合作用对N2a细胞的影响(200×)C: 0.1% 肥皂水与CVS-11混合作用对N2a细胞的影响(200×)；D：0.5% 肥皂水与CVS-11混合作用对N2a细胞的影响(200×)图4 0.05%～ 1% 肥皂水与CVS-11混合作用对N2a细胞的影响Note: A: CVS-11 virus infection group (200×); B: the mixture of CVS-11 virus with 0.05% soap solution effect on N2a cells (200×); C: the mixture of CVS-11 virus with 0.1% soap solution effect on N2a cells (200×); D: the mixture of CVS-11 virus with 0.5% soap solution effect on N2a cells (200×)Fig.4 The effect of mixture of 0.05%～1% soap solutions and CVS-11 on N2a cells

2.3 RT-PCR法检测狂犬病病毒N基因片段 将1%、 0.5%、0.1%和0.05% 浓度的肥皂水与病毒混合液分别感染BSR和N2a细胞，连续传代3次后收获悬液，离心取上清液进行狂犬病病毒N基因检测。检测结果如下 0.5% 和1% 浓度的肥皂水与病毒混合液感染BSR细胞和N2a细胞，连续3次传代后收集的上清液样品RT-PCR结果均为阴性； 0.05% 和0.1% 浓度的肥皂水与病毒混合液感染的BSR细胞和N2a细胞，连续3次传代后收集的上清液样品RT-PCR结果均为阳性，产物经琼脂糖凝胶电泳可见特异性条带约为250 bp(图5)。PCR扩增阳性样品经测序及软件比对发现，测序样品为狂犬病病毒N基因片段。RT-PCR检测结果与DFA检测的狂犬病病毒感染情况一致，进一步证明0.5% 浓度的肥皂水与狂犬病病毒作用后可使其完全灭活。

注：M：2000 Marker；1-4：依次为1%、 0.5%、0.1% 和0.05% 浓度的肥皂水与CVS-11混合液感染BSR细胞，连续3次传代后收集的上清液样品；5-8：依次为1%、0.5%、0.1% 和0.05% 浓度的肥皂水与CVS-11混合液感染N2a细胞，连续3次传代后收集的上清液样品；9：阴性对照； 10：阳性对照图5 RT-PCR检测BSR和N2a细胞中的狂犬病病毒N基因片段Note: M: 2000 Marker; 1-4: the mixture of CVS-11 with 1%,0.5%,0.1% and 0.05% soap solution infect the BSR cells in order, the supernatant collected after three passages;5-8: the mixture of CVS-11 with 1%,0.5%,0.1% and 0.05% soap solution infect the N2a cells in order, the supernatant collected after three passages; 9: negative control; 10: positive control.Fig.5 The results of RT-PCR detection of N gene segment of CVS-11 in BSR and N2a cells

3 讨论

狂犬病在全球广泛分布，全球每年约有60000 人死于狂犬病，是致死人数最多的动物源性传染病[6], 亚洲的狂犬病病例数居全球首位[7]，中国人间狂犬病发病仅次于印度， 2004—2014 年，狂犬病死亡人数一直高居我国传染病死亡数的前3 位[3]。2015年全国27个省份共报告病例801例，暴露后处置规范性有所提高，但仍未达到完全覆盖[8]。大多数人间狂犬病病例是由于被患狂犬病的动物咬伤所致，文献报道，犬咬伤后感染的时间是15～54 h，平均为25 h，因此在狂犬病暴露后，早期、正确的伤口处理极为重要[9]。狂犬病病毒对脂溶剂(肥皂水、氯仿、丙酮等)、乙醇、过氧化氢、高锰酸钾、碘制剂以及季铵类化合物(如苯扎溴铵)等敏感，及早用脂溶剂或弱洗涤剂(肥皂水或新洁尔灭溶液)反复冲洗伤口，即可起到冲洗作用也可分解狂犬病病毒的糖蛋白和脂蛋白，使病毒失去感染力并易被洗脱[4]。相对伤口未处理者，消毒或肥皂水冲洗加消毒的处理方法可以降低狂犬病发病的危险性[10]。

在临床工作中发现，配置的肥皂水时，多凭经验和感官来简单的判定肥皂水的浓度，随意性强，肥皂水的浓度究竟多少为宜？目前资料报道也不一致，有些资料认为可选用20%浓度的肥皂水，但本实验研究发现，20 g肥皂根本无法溶解于100 ml水溶液中，并且肥皂水是一种阴离子型的表面活性剂，有文献报道，10% 浓度的肥皂水能够引起兔肠粘膜的充血水肿，其程度随着浓度的升高而加重，认为临床上选用的肥皂水浓度应严格控制在1%[11]。然而，但肥皂水体外灭活狂犬病病毒的下限浓度及对细胞损伤程度尚不清楚，因此本实验选取了仓鼠肾细胞BHK-21的克隆细胞株BSR及小鼠神经瘤细胞N2a两种细胞模型，以此为工具评价不同浓度肥皂水对细胞损伤的影响及灭活细胞中狂犬病病毒的下限浓度。研究发现0.05%～ 1.0% 浓度的肥皂水对BSR和N2a细胞的生长均无影响，高于1%浓度的肥皂水均能引起两种细胞崩解死亡。Kaplan等[5]研究发现，1% 以上的肥皂或香皂溶液与狂犬病毒混合作用1～ 2 min后能使其完全灭活。本实验应用DFA和RT-PCR方法在细胞模型上检测了0.05%～ 1.0% 肥皂水浓度对狂犬病病毒的灭活作用，研究发现，终浓度为0.5% 的肥皂水与狂犬病病毒混合作用3 min后能使其灭活，0.1% 浓度的肥皂水不能完全抑制狂犬病病毒的存活，这与Kaplan等人的研究结果一致。但不同浓度的肥皂水在动物实验中灭活狂犬病病毒的情况尚不清楚，需要进一步探讨研究。

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(本文编辑：吕新军)

Experimental study on the inhibitory effect of soap solution on rabies viruses

Liu Shuqing, Wang Qian, Li Yanrong, Tao Xiaoyan, Yu Pengcheng, Lu Xuexin, Wu Weichen, Yan Jianghong, Zhu Wuyang

National Institute for Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Key Laboratory of Medical Virology, Ministry of Health, Beijing 102206, China

Zhu Wuyang, Email：zhuwuyang1971@sina.com

Objective To investigate the inactivating effect of soap solution on rabies virus and to explore the concentration of soap solutions which could be effective in post-exposure prophylaxis (PEP) of rabies virus infection. Methods The BSR and N2a cells were respectively infected by the mixture of different concentrations of soap solution and rabies virus CVS-11. Based on the direct immunofluorescent method (DFA) and reverse transcription PCR (RT-PCR), the inactivating effects of soap solutions on rabies viruse in BSR and N2a cells were detected, respectively. Results This experiment established the BSR or N2a cells model in 24 well cell culture plates, and we found that the upper limit of soap solution concentration which BSR or N2a cells could tolerate was 1%. The inhibitory effect test of different soap solution on rabies virus showed that the 0.5% concentration of soap solution could completely inhibit the survival of CVS-11 strain in both the BSR and N2a cells, but the 0.1% concentration of soap solution could not inhibit the rabies viruses completely. Conclusions The 0.5%-1% concentration of soap solutions could inhibit the survival of CVS-11 strain in three minutes in vivo experiment.

Rabies virus; Soap solutions; Inhibitory effect

朱武洋， Email：zhuwuyang1971@sina.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.03.010

狂犬病病毒；肥皂水；灭活作用

国家重点研发计划课题(2016YFC1200905)； 国家科技支撑计划(2014BAI13B04)；国家自然科学基金(31500152)；国家重点研发计划项目(2016YFD0500400)

2017-03-06)