玉米圆斑病菌侵染体系的建立

杨月 张潇雅 +孙冬梅 邓馨

摘要：以玉米自交系B73作为研究对象，以玉米圆斑病菌为供试菌株，采取玉米离体叶片侵染与活体整株侵染相对比的方式，通过观察侵染早期不同时间的玉米叶片，测定相关POD酶活性及相关基因表达量变化等，对侵染早期玉米叶片的生理指标和分子指标进行研究，通过比较这2种接菌方式对玉米早期生理生化表型的的影响，来筛选一种较为便捷实用的试验方法。结果表明，离体叶片侵染体系与活体植株侵染在侵染初期所选取的各种生理生化指标方面变化无差异；离体叶片侵染体系具有操作简单、重复性高、节约时间的优点，可以作为整株侵染的替代体系，为研究早期调控提供試验手段。

关键词：玉米；圆斑病菌；侵染体系；早期调控

中图分类号： S435.131文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）10-0081-03

玉米是一种重要的粮食作物，其播种面积和产量仅次于水稻、小麦居世界第3位，平均单产则居第1位[1]。玉米真菌病害是影响其产量的重要因素，其中，玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）和玉米圆斑病菌（Bipolaris zeicola）引起的叶部病害尤为常见[2-3]。1959年姜广正等首次报道我国发生玉米圆斑病[5-7]，该病可侵染玉米叶片、果穗、苞叶、叶鞘和茎秆等部位[8-9]。病原菌对植物的伤害大多与植物体内的活性氧代谢失调有关[4]，其中描述较多的为苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）与过氧化氢酶（CAT）等[5]。

研究表明，病原菌侵染植物时病程相关蛋白（pathogenesis-related protein，PRs）会发生相应的变化，且植物碱性亮氨酸拉链（basic leucine zipper，bZIP）类转录因子参与了病菌防御以及对各种环境胁迫的响应等[6]。碱性亮氨酸拉链（basic leucine zipper，bZIP）蛋白是真核生物所特有的一类转录因子，bZIP转录因子在人、动物、植物、微生物和昆虫中均有发现[7]。在植物中，bZIP家族中的不同成员参与多种生物学过程[8-9]，bZIP转录因子中的B亚族基因是驻膜转录因子（membrane-tethered transcription factors，MTTFs），参与内质网胁迫（ER）和其他逆境胁迫应答[10]。

由于整株侵染操作相对复杂，且条件控制较困难，重复性差。相比之下，离体叶片侵染反而可在短期内很好地模拟整株侵染的效果，但有关此方面研究未见报道。本试验以玉米圆斑病菌为研究材料，探讨了在离体和活体条件下，病害侵染初期植物体POD酶活性、防御过程中转录因子bZIP中B亚族的相关基因及病程相关蛋白的变化，为方便快捷地研究早期调控以及提供一种较好的试验手段打下基础。

1材料与方法

1.1试验材料

玉米自交系B73由中国农业大学巩志忠教授提供；玉米圆斑病菌由黑龙江八一农垦大学生命学院微生物实验室保存。

1.2培养基

马铃薯培养基（PDA），玉米苗浸汁培养基（玉米苗 200 g、葡萄糖20 g、琼脂粉20 g，加蒸馏水定容至1 000 mL）。

1.3试验方法

1.3.1病原菌纯化、扩繁

在无菌操作台中，用接种环挑取病原菌菌种菌丝于玉米苗浸汁培养基上活化，放入28 ℃恒温培养箱倒置培养，待菌丝长至满皿。长好的病原菌用打孔器在培养基上竖直打成直径0.5 cm的菌碟，有菌一面朝下接种于PDA培养基上，28 ℃恒温倒置培养。待菌丝布满整个培养基即可从培养箱取出，室温放置黑暗处，促进孢子萌发。

1.3.2玉米的种植

萌发：营养花卉土（灭菌）按1 ∶[KG-*3]1配蛭石混匀后称100 g置于直径10 cm小花盆中，小花盆放置于水盆中浸透水，玉米种子直接播种于浸透水的花盆中，深度约为1～1.5 cm，置于人工气候箱（28 ℃、16 h光照8 h黑暗）中培养，约3 d后即可萌发。

移苗：待幼苗生长至3叶1心期时移入直径40 cm的大花盆中，按“大田土 ∶[KG-*3]草炭=1 ∶[KG-*3]1”混匀，同时施加底肥（氮磷钾复合肥），用镊子小心将小苗整株挖出后轻轻抖落根部泥土，若残留太多可在水盆中轻轻涮洗后再移入土中（尽量不要伤根），随后浇足量的水。移苗后于温室中培养，保持室内温度为30 ℃，相对湿度60%，定期观察调节温度、湿度计和通风机及水帘，每周浇水1次，同时追肥，按照5 g复合肥溶于10 L自来水中的比例，每盆浇水3 L。

1.3.3玉米叶片侵染处理

离体：取生长发育及孢子萌发均匀的病原菌平皿，用打孔器打下同样大小的菌碟备用。玉米生长到约7叶1心期时剪下第3张和第4张叶子，取发育状态相近的3～5 cm 1段放入铺有湿润滤纸的直径90 mm玻璃培养皿中，正面朝上，将打好的菌碟有菌一面朝下紧贴叶片放好，每段叶片上均匀放置3个菌碟，每皿2张叶片，盖好皿盖，放于28 ℃培养箱保温，分别于接菌后2、12、24 h取样，以未接菌的叶片作为空白对照，每个处理3次重复。

活体：病原菌同样用打孔器打好菌碟备用。取相同生长阶段的玉米，连同小花盆一起放入大号透明塑料箱中，底部加湿润滤纸，用支架固定叶片，将病原菌菌碟接种于叶片上，盖好盖子，保持温度、湿度，取样方式同离体叶片。

1.3.4叶片透明与显微观察

取大约0.5 cm2大小的叶片于“无水乙醇 ∶[KG-*3]冰醋酸=1 ∶[KG-*3]1”的固定液（现用现配）中固定24 h，蒸馏水冲洗后放入饱和水合氯醛溶液中1 h即完成透明。取出叶片用蒸馏水冲洗干净残留液体，放在载玻片上，加1滴苯胺蓝染色10 min，用蒸馏水冲洗掉染液滴加1滴50%甘油，盖上盖玻片，进行显微观察。

1.3.5过氧化物酶（POD）酶活测定

愈创木酚法[11-12]进行POD的测定：在pH值7.8的PBS中加入3 mL POD反应液于比色皿中，以此作为调零组300 μL，试验组粗酶液稀释10倍取300 μL加入3 mL反应液，在470 nm下每隔1 min读数1次，共读5次。以1 min D值变化（升高）0.01为1个酶活性单位（U）来计算结果。

[JZ]POD[U/（g·min）]=（ΔD470 nm×Vt）/（m×Vs×0.01×t）。

式中：ΔD470 nm为反应时间内吸光度的变化；m为样品鲜质量，g；t为反应时间，min；Vt为提取酶液总体积，mL；Vs为测定时取用酶液体积，mL。

1.3.6光合荧光参数测定和数据分析

将接菌后不同时间取样的玉米叶片暗处理30 min，使用调制叶绿素荧光成像系统测定荧光参数Fv/Fm，数据用Imaging Win v2.41a读出，导入Excel中进行分析。Fv/Fm表示PSⅡ的最大光合潜能，计算公式为Fv/Fm=（Fm-Fo）/Fm。

1.3.7关键基因表达量分析

利用TaKaRa公司的RNAiso Plus（Total RNA提取试剂盒）进行提取玉米叶片RNA。经 M-MLV反转录成cDNA，然后利用Toyobo公司的SYBRGreen Realtime PCR Master Mix进行Real-time PCR。反应程序为：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，共40個循环。以18S作为内参，采用2-ΔΔCt法分析基因相对表达量。

2结果与分析

[HTK]2.1玉米圆斑病菌离体侵染与整株活体侵染及显微观察[HT]

由图1可见，离体叶片和活体叶片接菌后，玉米圆斑病菌均在接菌处理2 h开始萌发，12 h菌丝伸长侵入组织，24 h菌丝大量繁殖。表明离体叶片接菌和整株活体接菌对玉米圆斑病菌的侵染过程并未产生影响，试验中可以替代活体植株。[FL）]

由图2可见，玉米圆斑病菌侵染后，离体叶片和活体整株叶片的POD酶活性呈现出先下降后升高再下降的相同趋势，但变化均并不明显，整体来看趋于稳定。

2.3光合荧光参数测定

光合荧光参数Fv/Fm表示光合系统Ⅱ（PSⅡ）的最大光合潜能，是反映植物生长状态的一项重要生理指标。由图3可见，接种玉米圆斑病菌后叶片的光合荧光参数Fv/Fm变化不大，一直处于正常范围内，说明在侵染前期，植株并未受到明显影响。从图3中还可看出，离体叶片和活体叶片的光合荧光参数Fv/Fm都是处于正常范围内小幅波动。

2.4圆斑病菌侵染后关键基因表达量分析

玉米圆斑病菌后[WTBX][STBX]pr3、pr5[WTBZ][STBZ]基因的Real-time PCR结果。由图4可见，离体叶片接菌24 h引起[WTBX][STBX]pr3和pr5[WTBZ][STBZ]基因表达急剧上调，活体侵染12～24 h同样引起了上述2个基因的显著上调。说明无论是离体叶片还是活体叶片，病菌的侵入均调控了相关标记基因的表达，植物体启动了抵抗病菌侵入的程序来对抗病菌的入侵，即pr基因表达上调。

bZIP转录因子是植物中普遍存在的一类转录因子，参与各种胁迫的早期调控，其中B亚族为驻膜转录因子，在正常条件下存在于内质网膜上，当受到侵害时会调控相关应答基因的表达，来抵抗外界胁迫。bzip28、bzip17和bzip60都是驻膜转录因子，由图5可见，在玉米圆斑病菌侵染玉米后，无论是离体叶片还是活体叶片中的[WTBX][STBX]bzip28[WTBZ][STBZ]表达量均明显上调，二者表现一致。

3结论与讨论

本试验通过2种病原菌对玉米进行短期侵染试验，分别采[CM（25]用离体叶片侵染和整株活体侵染2种方法的比较，期间对

2种侵染方法的叶片进行显微观察、POD酶活性测定、NBT活性氧染色、光合荧光参数测定以及关键基因的表达量分析来对比2种侵染体系在侵染前期对植物的影响。结果表明，离体叶片侵染和整株活体侵染在侵染前期并无明显差别，而离体叶片侵染较活体整株侵染操作简单且重复性好。结果表明，在研究侵染前期病原菌诱导病害相关基因调控下游靶基因的信号途径时，可以采用较为方便快捷且节省试验材料的方法来进行取样，离体叶片侵染可以满足试验要求。

bZIP类转录因子在总数上占较大比重，且不同的物种所含有bZIP转录因子基因家族成员不同。对于植物在逆境下的基因表达调控具有重要作用。转录因子也称反式作用因子，可以直接或间接地识别或结合在各类顺式作用元件核心序列上，从而参与调控靶基因转录效率的蛋白质，广泛参与植物低温、干旱、高盐、抗病等逆境应答以及植物生长发育的调控。以往的bZIP转录因子很多研究主要集中在非生物胁迫如干旱、高盐、激素等作用中的调节机制，但对生物胁迫下bZIP转录因子的功能研究报道较少，尤其在对病原菌侵染的应答方面研究还不是很完善。通过圆斑病菌侵染离体与活体植株的研究证实，bZIP转录因子在信号传导途径前期发挥作用，在侵染24 h时叶片仍然维持正常的生理状态。在保温保湿的条件下，72 h后叶片出现叶边缘发黄萎蔫的情况，白亚君等指出，在接菌的时候为了避免菌碟脱落需要用木片或线绳固定[16]，这就给试验造成了一定的困难，本试验采用的离体接菌方式在培养皿中接菌，不存在菌碟脱落的困扰，结合以上试验数据可初步判定，在病菌侵染早期，即72 h以内可以采用离体叶片接菌的方式作为一种方便快捷的试验方法。

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