提取枸杞棉蚜基因组DNA的9种方法比较

李琳琳 严林 金生英 谢久祥 温小成

摘要：为探讨适合枸杞棉蚜基因组DNA提取的方法，采用9种方法提取枸杞棉蚜基因组DNA，并对每种方法提取的DNA样本质量进行综合比较分析。结果表明，改进十二烷基硫酸钠（SDS）法、优化KAc法、STE精提法、Chelex粗提法、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法、盐析法均可从枸杞棉蚜中提取总DNA，浓度高且所制备出的DNA均可成功应用于mtDNA CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因扩增。STE粗提法、Chelex精提法、饱和NaCl法Ⅱ提取的枸杞棉蚜基因组DNA质量低，不能满足分析要求。改进SDS法及STE精提法所制备的DNA质量较佳、产量较高、实用性强，是值得推广应用的枸杞棉蚜基因组DNA提取方法。盐析法提取DNA，试剂成本低、毒性小，是一种安全有效的枸杞棉蚜基因组DNA提取方法。Chelex粗提法是一种快速的枸杞棉蚜基因组DNA提取方法。

关键词：枸杞；棉蚜；基因组DNA；提取方法

中图分类号： S435.671文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）10-0030-04

枸杞棉蚜（Aphis gossypii Glover）属同翅目（Hompotera）蚜科（Aphididae）蚜属（Aphis），是我国西北地区栽培枸杞（Licium barbarum L.）分布地的主要害虫，短期内可暴发成灾，引起枸杞果产量和品质严重下降[1]。棉蚜具有明显的生物型[2-3]，如棉花型和黄瓜型[4-5]，而枸杞棉蚜属于何种生物型亟待验证。确定昆虫的生物型，不仅需要采用传统的生物学特征和生态学参数比较[4，6-7]，而且需要分子遗传学数据佐证[2，7-8]。

单头枸杞棉蚜基因组DNA提取是开展枸杞棉蚜分子遗传学研究的前提与基础[9]。由于枸杞棉蚜体型微小，体表有外骨骼，其DNA提取有一定难度。Black等通过十二烷基硫酸钠（SDS）方法提取蚜虫基因组DNA，并通过随机扩增多态性DNA-PCR（RAPD-PCR）检测蚜虫多态性[10]；龚鹏等在棉蚜DNA的提取中采用STE精提法，用简单重复序列PCR（SSR-PCR）技术研究了棉花和木槿上棉蚜的多态性[11]；安瑞生等对KAc法、SDS法的研磨步骤进行了改进[12-13]；张帆对改进后的KAc法中加入蛋白酶K进行了优化，并用 mtDNA-CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]技术研究了棉花型、黄瓜型棉蚜的多态性[14]。目前，国内最常用的2种棉蚜基因组DNA提取方法为改进SDS法和优化KAc法。国外棉蚜基因组DNA提取常采用SDS法[2，8]，以及Chelex粗提法[7，15]。

為筛选出适合枸杞上棉蚜基因组DNA的提取方法，本研究借鉴国内外应用较多的提取蚜虫DNA的8种方法对其稍作改进，即改进SDS法、优化KAc法、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法、盐析法、饱和NaCl法Ⅱ、STE粗提法、Chelex粗提法、STE精提法，并参照Chelex粗提法自创了Chelex精提法，对这9种方法提取的基因组DNA的质量、DNA提取所需时间、操作难易程度和所用试剂的毒性大小进行综合比较，为进一步开展枸杞棉蚜遗传结构分析奠定基础。

1材料与方法

1.1试验材料

于2015年7—8月在青海诺木洪枸杞主产区蚜虫发生较重的栽培枸杞田，采集无翅蚜虫成虫，每株枸杞采集1头试虫，每头试虫所在植株至少间隔5 m，样品单头分别放于盛有无水乙醇的1.5 mL离心管中浸泡，于4 ℃低温采样箱内保存，带回实验室后，于-40 ℃超低温冰箱保存备用。试验时随机抽取。

1.2基因组DNA的提取方法

改进SDS法：参照杨子祥等的改进SDS法[16]，稍作改进。具体方法：将单头蚜虫在双蒸水中漂洗，滤纸吸干后转入1.5 mL离心管中，加入100 μL匀浆液（按A液 ∶[KG-*3]B液 ∶[KG-*3]C液体积比25 ∶[KG-*3]3 ∶[KG-*3]2配制。其中A液：Tris-HCl 10 mol/L，NaCl 01 mol/L，EDTA 1 mol/L，pH值为8.0；B液：10% SDS；C液：蛋白酶K 10 mg/mL）。用灭菌玻璃研磨棒对蚜虫进行研磨。并用500 μL匀浆液冲洗研磨棒，56 ℃水浴4 h（若裂解液未透明，水浴时间延长至8 h），其间摇匀3～4次。加入600 μL Tris饱和酚，在摇床上缓慢摇匀20 min后，7 000 r/min 离心10 min，取上清液。加入600 μL三氯甲烷 ∶[KG-*3]异戊醇（体积比为24 ∶[KG-*3]1），在摇床上缓慢摇匀20 min后，7 000 r/min 离心 10 min，取上清液。加入600 μL无水乙醇（-20 ℃预处理），混匀，-20 ℃冰箱内放置1 h以上。12 000 r/min 离心 10 min，弃去上清液。加入600 μL 70%乙醇（-7 ℃预处理），12 000 r/min离心10 min，弃去上清液。自然干燥后，加入20 μL ddH2O溶解，-20 ℃保存。

优化KAc法：参照张帆的优化KAc法[14]。

STE粗提法：参照Gomi等的STE粗提法[17]，挑取蚜虫方法同改进SDS法中的挑取方法，加入20 μL STE缓冲液（100 mmol/L NaCl，10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH值为8.0），用玻璃研磨棒研磨，加入1.6 μL蛋白酶K（10 mg/mL）；简单离心后，37 ℃孵育30 min；95 ℃初始变性5 min；简单离心后，-20 ℃保存。

Chelex粗提法：参照Carletto等的Chelex粗提法[7，15]，蚜虫在0.65%（质量分数）NaCl溶液中洗2次；将蚜虫放入 1.5 mL 离心管中，管内放有55 μL 5%（质量分数）Chelex树脂溶液，用玻璃研磨棒研磨；56 ℃水浴30 min，在100 ℃水浴7 min；5 000 r/min离心1 min，取上清液，-20 ℃保存。

STE精提法：参照龚鹏等的STE精提法[11]，在STE粗提法的基础上进行改进，挑取单头蚜虫置于1.5 mL离心管内分别加入200 μL STE缓冲液（100 mmol/L NaCl，10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH值为8.0），用玻璃研磨棒研磨，分别向离心管内再加入500 μL匀浆液、1.6 μL蛋白酶K（10 mg/mL），56 ℃水浴4 h；剩余步驟参照改进SDS法进行酚-三氯甲烷抽提，无水乙醇沉淀DNA，溶解保存。

Chelex精提法：在Chelex粗提法的基础上进行改进，蚜虫在0.65%（质量分数）NaCl溶液中洗2次；将蚜虫放入 1.5 mL 离心管中，管内放有100 μL 5%（质量体积比）Chelex树脂溶液，研磨；分别向离心管内再加入500 μL匀浆液、2 μL蛋白酶K（10 mg/mL），56 ℃水浴4 h；剩余步骤参照改进SDS法进行酚-三氯甲烷抽提，无水乙醇沉淀DNA，溶解保存。

CTAB法：参照韩玉翠等的CTAB法[18]，稍作改进。具体步骤如下：挑取蚜虫于离心管中，加入50 μL CTAB 缓冲液[2%CTAB，0.1 mol/L Tris-HCl（pH值为8.0），0.02 mol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl，0.2% β-巯基乙醇]，用灭菌玻璃研磨棒对蚜虫进行研磨。并用150 μL CTAB缓冲液冲洗研磨棒；65 ℃水浴1 h；取出后加入1 U RNA酶，置于37 ℃温箱中1 h；取出后加入500 μL三氯甲烷-异戊醇（体积比为 24 ∶[KG-*3]1），缓慢摇动混匀，13 000～15 000 r/min离心15 min；取上清液（约 150 μL），加入2倍体积的冰无水乙醇，约1/10体积NaAc（3 mol/L，pH值为5.2），混匀后置于-20 ℃ 3 h以上；13 000 r/min 离心15 min，弃上清液，用70%乙醇（-20 ℃ 预处理）清洗2次；室温干燥，加入20 μL TE缓冲液溶解，于-20 ℃ 保存。

盐析法：参照Sunnucks等的盐析法[19]，稍作改进。具体步骤如下：挑取蚜虫于离心管中，加入20 μL TNES提取缓冲液（50 mmol/L Tris-HCl，pH值为7.5，400 mmol/L NaCl，20 mmol/L EDTA，0.5% SDS），用灭菌玻璃研磨棒对蚜虫进行研磨，并用200 μL TNES冲洗研磨棒；再加入5 μL蛋白酶K（20 mg/mL），轻摇混匀，于60 ℃水浴1 h（中间取出摇匀1次）；加入80 μL 5 mol/L NaCl，用力摇动15 s，4 ℃、14 000 r/min 离心5 min，取上清液；加入300 μL预冷的无水乙醇轻轻混匀，-20 ℃放置30 min；4 ℃、14 000 r/min离心 5 min，弃上清液；加入300 μL 75%乙醇（-20 ℃预处理）洗涤，4 ℃、14 000 r/min离心5 min，弃上清液；在室温下干燥，然后加20 μL灭菌ddH2O，充分溶解后-20 ℃保存备用。

饱和NaCl法Ⅱ：参照马丽滨等挑取蚂蚁的饱和NaCl法Ⅱ[20]。

1.3基因组DNA纯度及浓度检测

对9种方法提取的DNA浓度和纯度进行检测。用Biowave DNA型蛋白核酸分析仪测定DNA纯度和浓度。纯度由D260 nm/D280 nm值确定，该值介于1.7～1.9之间时DNA纯度较好，以测量值为参数确定DNA浓度。

1.4基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测

采用1%琼脂糖凝胶（添加了0.01% GoldView I型核酸染色剂）电泳，将8.0 μL DNA、2 μL 6×Loading Buffer混匀后上样，电泳条件为140 V，30 min，经Gel Doc凝胶成像系统（购自美国BIO-RAD公司）照相和分析。DNA的条带无拖尾、无RNA污染，点样孔无酚、蛋白质残留，可用于mt-DNA CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]扩增研究。

1.5PCR 扩增及检测

参照张帆使用的棉蚜CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]引物[14]，上游引物为CAL：5′-TAATAACGAACAGGAACAG-3′，下游引物为CAR：5′-TAGTTGCTGATGAAGTAG-3′，委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。扩增体系为50 μL：25μL Premix TaqTM（TaKaRa TaqTMVersion 2.0 plus dye），1 μL上游引物，1 μL下游引物，1 μL DNA，22 μL ddH2O。扩增程序为94 ℃预变性 2 min；94 ℃变性1 min，50 ℃退火50 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃终延伸10 min。PCR产物于-20 ℃保存。

PCR产物经1%琼脂糖凝胶（添加了0.01% GoldView I型核酸染色剂）电泳检测（140 V，30 min），上样量为每孔 10 μL，经Gel Doc凝胶成像系统照相和分析。其中CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因在电泳中检测到目标片段后，将40 μL扩增产物送往生工生物工程（上海）股份有限公司测序，以PCR引物为测序引物，在ABI3730测序仪上进行正向测序。

2结果与分析

2.1基因组DNA纯度及浓度检测

通过9种方法提取单头枸杞蚜虫样品，检测DNA的浓度和纯度，如表1所示，改进SDS法、STE精提法、Chelex粗提法提取DNA样品浓度的平均值分别为264.33、225.00、256.67 ng/mL，D260 nm/D280 nm 平均值分别为1.73、1.84、1.73，均为高质量DNA；CTAB法、盐析法、饱和NaCl法Ⅱ提取DNA样品浓度的平均值分别为316.67、456.67、216.67 ng/mL，D260 nm/D280 nm平均值分别为1.94、1.94、1.90，可见DNA中有少量RNA的污染；Chelex精提法提取DNA样品浓度的平均值为36.67 ng/mL，D260 nm/D280 nm平均值为213，说明DNA中有大量RNA的污染，DNA浓度过低；优化KAc法提取DNA样品浓度的平均值为318.33 ng/mL，D260 nm/D280 nm平均值为1.63，说明DNA中有蛋白质或酚的污染；STE粗提法提取DNA样品浓度的平均值为834.67 ng/mL，D260 nm/D280 nm平均值为146，说明DNA中有大量蛋白质或酚的污染。

2.2基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测

9种提取枸杞棉蚜基因组DNA方法的电泳检测结果如图1、图2所示，改进SDS法、STE精提法、CTAB法、盐析法显示DNA主带明显，其中改进SDS法、STE精提法中有RNA条带；饱和NaCl法Ⅱ条带暗，说明浓度低；优化KAc法DNA主带不明显，DNA不完整，有降解；STE粗提法、Chelex粗提法、Chelex精提法均无DNA条带， 说明STE粗提法、Chelex粗提

法提取的DNA含大量杂质，无法检测出DNA主条带，Chelex精提法提取的DNA浓度极低，因而无法检测出DNA条带。

2.3PCR扩增及检测

按照“1.5”节中的方法进行CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]引物的特异性扩增，结果显示，STE粗提法、Chelex精提法、饱和NaCl法Ⅱ没有扩增到特异性条带，而其余6个方法均扩增到目的条带，且目的条带清晰，如图3、图4所示。

2.4测序结果分析

以改进SDS法、优化KAc法、STE精提法、Chelex粗提法、CTAB法、盐析法提取的枸杞蚜虫的基因组DNA为模板，以CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]引物扩增的产物均能达到测序要求，获得成功测序，

部分测序结果如图5所示。将所测定的蚜虫CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因序列在GenBank数据库中进行比对，根据结果判定为棉蚜。

3讨论与结论

本研究首次采用国内外9种方法对枸杞棉蚜基因组DNA[JP]提取进行了比较试验。结果表明，改进SDS法、STE精提法、Chelex粗提法、CTAB法、盐析法均可有效地提取枸杞棉蚜基因组DNA，并成功应用于mtDNA CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因的扩增；饱和NaCl法Ⅱ可以提取枸杞棉蚜DNA，但质量较低，在CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]扩增中不能显示出DNA条带；STE粗提法、Chelex精提法提取的枸杞棉蚜基因组DNA质量低，不能满足分析的需求。

杨子祥等认为改进SDS法优于KAc法[13]，本试验的结果[CM（25]与之一致。在用改进SDS法提取棉蚜DNA过程中，采用[CM）]

无水乙醇沉淀DNA也能制备出高质量棉蚜的DNA，满足 CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）] 扩增需求；张帆采用优化KAc法成功提取棉蚜DNA，并满足CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]扩增[14]，本研究采用优化KAc法提取的DNA虽能满足CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]扩增，但提取的DNA样品不完整，D260 nm/D280 nm 值低于165，原因可能是枸杞棉蚜较棉花棉蚜、黄瓜棉蚜体壁颜色深，该方法不能有效去除色素杂质，并且研磨时间长，导致提取的DNA样品降解。

龚鹏等采用STE精提法需要30头棉蚜混合制备高质量DNA[11]，而本研究用单头棉蚜也可以提取出相同质量的棉蚜DNA，说明STE裂解液能有效释放枸杞棉蚜的DNA，经由酚-三氯甲烷抽提可以有效去除杂质，即制备出高质量的DNA。本研究STE粗提法未能快速提取枸杞棉蚜高质量的DNA，与Gomi等的研究结果[17]不一致，Gomi等采用STE粗提法提取单头叶螨DNA，满足16S rDNA的分析，原因可能是STE粗提法提取枸杞棉蚜DNA时，水浴条件为37 ℃、30 min，导致蛋白质、多糖等杂质不能完全降解。是否可以通过提高水浴温度、延长孵育时间使蛋白质等杂质完全降解，有待进一步验证。

本研究表明，盐析法也适用于棉蚜DNA的提取，与前人试验结果一致，他们通过盐析法高效地提取了大豆蚜[21]、麦长管蚜[22]、烟粉虱[23]的DNA，其中张烨等采取液氮破碎虫体[22]，本研究改进使用灭菌玻璃研磨棒研磨虫体，也可提取相同质量的DNA，使操作更加简便。

采用CTAB法提取枸杞棉蚜DNA过程中，采取无水乙醇沉淀DNA无法制备高质量的DNA，与韩玉翠等的研究结果[18]一致，韩玉翠等用CTAB法提取麦长管蚜、高粱蚜DNA，认为异丙醇沉淀DNA优于无水乙醇沉淀DNA[18]。使用异丙醇沉淀DNA能否制备高质量棉蚜DNA有待进一步验证。

胡尊瑞等采用CTAB法、饱和NaCl法Ⅱ、盐析法提取桃蚜DNA时，认为饱和NaCl法Ⅱ优于其他方法[24]，本試验结果与之不一致，表明饱和NaCl法Ⅱ不适用于提取枸杞棉蚜DNA，原因可能是试验材料物种不同。

Chelex粗提法是国外常用的提取棉蚜DNA的方法，本试验也证明Chelex粗提法能够快速地提取高质量的枸杞棉蚜DNA。Chelex精提法，提取DNA浓度极低，不能满足CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]分析，原因可能是Chelex-100为化学离子螯合树脂，Chelex-100吸附DNA，经酚抽提时，DNA也进入有机相，故上层水相中无DNA。

综上所述，在时间充裕并要求提取高产量、高质量的DNA情况下，提取枸杞棉蚜DNA建议选用改进SDS法、STE精提法；在要求减少对试验人员毒害的前提下，建议选用盐析法，此方法在安全性及时间方面优于改进SDS法、STE精提法；在时间紧促情况下，建议选用Chelex粗提法，该方法操作简单，耗时最少，Chelex-100使用手册上指出该法所获得DNA模板保存时间较短，应在1周内使用。因此，可以根据试验目的、试验成本等情况综合考虑，选取合适的枸杞棉蚜基因组DNA提取方法。

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