超微粉碎处理对小麦面筋蛋白性质的影响
2017-07-19郭武汉关二旗
郭武汉 关二旗 卞 科
(河南工业大学粮油食品学院,郑州 450001)
超微粉碎处理对小麦面筋蛋白性质的影响
郭武汉 关二旗 卞 科
(河南工业大学粮油食品学院,郑州 450001)
研究超微粉碎处理对小麦面筋蛋白结构和功能性质的影响,为拓宽小麦面筋蛋白的应用领域提供理论依据。以小麦面筋蛋白为原料,经超微粉碎处理,得到6种不同粒度的面筋蛋白样品,借助傅里叶变换红外光谱仪(FTIR)、紫外可见分光光度计等设备,以及常规化学分析方法,研究超微粉碎处理对面筋蛋白巯基含量、二级结构、溶解性、起泡性、乳化性等的影响。结果表明,经超微粉碎处理后,面筋蛋白粉体的粒度(D50)由109.35 μm减小到3.60 μm。随着面筋蛋白粉体粒度的减小,总巯基含量显著下降,暴露巯基含量则呈先增后减的变化规律。FTIR分析表明,超微粉碎后面筋蛋白的β-折叠、无规卷曲结构显著增加,分子柔性显著提高。蛋白功能特性分析结果显示,随着粉体粒度的减小,面筋蛋白的溶解度发生显著变化;起泡性和乳化性均得到显著改善。其中,面筋蛋白的起泡能力提高了50%,泡沫稳定性提高了20%,乳化活性提高了6%,乳化稳定性提高了1.1%。因此,超微粉碎处理对面筋蛋白的结构和功能性质有显著影响。采用超微粉碎技术对面筋蛋白进行处理,粒度(D50)达到5 μm左右时,其巯基含量发生显著变化,蛋白柔性显著提高,溶解度发生明显变化,乳化性、起泡性得到显著改善。
小麦面筋蛋白 超微粉碎 巯基 二级结构 功能特性
小麦面筋蛋白主要是蛋白单体或通过二硫键形成的高分子化合物,是小麦的主要贮藏蛋白[1-2],主要由醇溶蛋白和谷蛋白构成,营养价值较高,但较低的溶解度、乳化性等功能特性限制了小麦面筋蛋白在食品和非食品工业中的应用[3]。超微粉碎技术是利用机械或流体动力的方式克服固体内部凝聚力使物料破碎的粉碎技术,可使物料的粒度达到10~25 μm,甚至达到1 μm的超细粉体水平[4]。有研究表明蛋白粉体粒度的变化对其半胱氨酸含量、溶解度及消化吸收能力均有显著影响[5]。因此,研究超微粉碎对蛋白结构和功能性质影响的客观规律,对于改善蛋白质特性、拓宽蛋白质资源的利用范围具有重要的实际应用价值和科学指导意义。目前,许多学者致力于研究超微粉碎处理对蛋白质理化性质和功能特性的影响。Zhao等[6]研究发现,姜粉经过超微粉碎后,其蛋白的溶解度明显提高。Sun等[7]利用高能纳米球磨机粉碎乳清蛋白,发现微细化乳清蛋白粉的乳化性得到显著改善。Hayakawa等[8]认为超微粉碎对大豆分离蛋白疏水性并无显著影响,但当酪蛋白粒度减小到10 μm以下时,其表面疏水性显著增加。关二旗[9]研究认为,超微粉碎对小麦粉面筋指数和沉淀值均有显著改善作用。张慧等[10]研究表明,超微粉碎后小麦面筋蛋白的白度值、起泡性、乳化性、持水性和持油性均随粒度的减小而提高。但是,目前关于超微粉碎对小麦面筋蛋白结构及其功能性质的影响鲜见报道。本研究以小麦面筋蛋白为原料,采用超微粉碎手段对其进行处理,借助激光粒度仪、红外光谱、紫外可见分光光度计等检测设备,以及常规化学分析方法,研究超微粉碎前后小麦面筋蛋白粉体粒度、巯基含量、二级结构和功能性质的变化规律,初步探讨超微粉碎处理导致小麦面筋蛋白功能性质变化的机理,以期为小麦蛋白资源的开发利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
小麦面筋蛋白(粗蛋白质质量分数84%):河南莲花味精股份有限公司;福林酚试剂:Sigma公司;2-硝基苯甲酸:Aladdin;三羟甲基氨基甲烷(Tris)、尿素、酒石酸钾钠:洛阳市化学试剂厂;乙二胺四乙酸:洛阳昊华化学试剂有限公司。
1.2 主要仪器与设备
Mastersizer 2000激光粒度仪:英国马尔文仪器有限公司;UV-2000紫外可见分光光度计:尤尼柯(上海)仪器有限公司;5810R台式高速大容量离心机(冷冻型):德国Eppendorf仪器有限公司;WQF-510傅里叶变换红外光谱仪:天津天光有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 超微粉体制备
设定气流压力为(0.80±0.5)MPa,气流温度为-10~10 ℃,调整气流粉碎机变频电机转速3 000~15 000 r/min及粉碎次数,制备不同粒度的小麦面筋蛋白超微粉体样品。
1.3.2 粒度测定
采用激光粒度分析仪检测小麦面筋蛋白超微粉体的粒径及粒度分布情况。D50表示在粒径累积分布曲线上,50%的样品颗粒直径小于或等于此值。
1.3.3 巯基含量测定
参照Hu等[11]的方法,略改动:15 mg 样品溶于5.0 mL溶解液[Tris-Gly(甘氨酸)-Urea(8 mol/L) 溶解液用于测定总巯基含量,Tris-Gly溶解液用于测定暴露巯基含量]中。然后加入0.05 mL DTNB溶液(4 mg/mL,Tris-Gly溶解液配制)。悬浮液置于25 ℃条件下1 h,偶尔振荡。然后12 000 r/min离心10 min。测定上清液在412 nm处的吸光度,试剂溶解液作为空白。以13 600(mol·L-1·cm)-1消光系数计算巯基含量。
1.3.4 小麦面筋蛋白二级结构分析
参照Dominique等[12]的方法:将样品预先置于盛有硅胶粒的干燥器中,放置至样品湿基含水量为0%(105 ℃恒重法测定)。然后称取2 mg样品与200 mg KBr研磨均匀,压片,测定FTIR。扫描范围4 000~400 cm-1,分辨率4 cm-1,扫描次数32。谱图分析采用Peakfit 4.12软件分析,在酰胺I带1 600~1 700 cm-1范围内两点基线校正,去卷积,二阶导数,Gaussian 曲线拟合,参照Kim等[13]的方法计算α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲所占比例。
1.3.5 溶解度测定
超微粉碎小麦面筋蛋白粉体溶解度的测定参照Yalcin等[14]的方法,稍作改动:称取0.3 g样品溶于30 mL蒸馏水中,搅拌10 min,然后采用0.5 mol/L HCl或0.5 mol/L NaOH调节溶液pH为pH 2.0、4.0、5.0、6.0、8.0、10.0,室温下搅拌1 h后,20 ℃、10 000 r/min条件下离心20 min;取适量上清液适当稀释,使吸光度值为0.2~0.8,参照Lowry法测定上清液蛋白质含量,以牛血清白蛋白为标准蛋白绘制标准曲线。溶解度表示为上清液中蛋白含量占总蛋白含量的百分比。
1.3.6 起泡性测定
参照Yu等[15]的方法:取2%样品溶液(0.01 mol/L pH 7.0磷酸缓冲液配制)20 mL,10 000 r/min条件下均质2 min,迅速转移到100 mL量筒中测定起泡性。其中,起泡能力为均质后蛋白质悬浮液增加的体积百分比,泡沫稳定性为静置30 min后泡沫保留的百分比。
1.3.7 乳化性测定
参照Qiu等[16]的方法,稍作改动:0.1%样品溶液21 mL(0.5 mol/L HCl 调节溶液pH为4.0),先均质20 s,然后加7 mL花生油,室温下10 000 r/min均质1 min,分别在均质后0、10 min后从溶液底部吸取0.05 mL溶液,加5 mL 0.1%的SDS溶液,500 nm处测吸光度,以SDS溶液为空白。乳化活性指数EAI/m2/g=2×(2.303A0)×N×10-4/φLC
式中:N为稀释倍数;φ为体系中油相所占的分数(本研究中的油相占25%);C为蛋白质的质量浓度/g/mL;L为比色池光径(1 cm)。
乳化稳定性ES=A0×ΔT/(A0-A10)
式中:A0为0 min的吸光值;A10为10 min时的吸光值;ΔT为时间差/min。
1.3.8 数据处理
采用SPSS16.0软件对数据进行分析处理;采用邓肯氏新复极差法进行多重比较,检验水平为P<0.05;采用Origin8.0 软件处理作图。
2 结果与分析
2.1 超微粉碎小麦面筋蛋白粒度分析
采用气流粉碎机对小麦面筋蛋白进行干法粉碎,通过调整变频电机转速和控制粉碎次数,依次得到6种小麦面筋蛋白超微粉碎样品,其粒度测定结果列于表1。在变频电机转速为6 000 r/min的条件下进行一次粉碎,小麦面筋蛋白粉体颗粒粒径D50为17.91 μm,达到超微粉体的粒径范围要求(10~25 μm),且比表面积增加了3.4倍。随着变频电机转速的提高和粉碎次数的增加,小麦面筋蛋白的粒径不断减小,比表面积不断增大。当变频电机转速达到15 000 r/min时,对小麦面筋蛋白进行6次粉碎,其粒径D50减小至3.60 μm,比表面积为3.17 m2/g,比表面积较对照样品A增加了19.8倍。
表1 超微粉碎小麦面筋蛋白粒度分布
2.2 超微粉碎处理对小麦面筋蛋白巯基含量的影响
从图1可知,经过超微粉碎处理,随着粉体粒度的减小,小麦面筋蛋白中总巯基含量逐渐降低。当粉体粒度D50减小到3.60 μm时,总巯基含量降低至3.66 μmol/g。与对照样品A相比,超微粉碎后小麦面筋蛋白的暴露巯基含量均有所增加,但不同粒度的小麦面筋蛋白超微粉体的暴露巯基含量则呈现出先增后减的变化规律。当粉体粒度D50减小到11.94 μm时,暴露巯基含量达到最大值,为1.77 μmol/g。上述分析结果表明,小麦面筋蛋白经过超微粉碎处理后,随着粉体粒度的减小,埋藏(或包裹)于分子内部的巯基将会暴露出来,但在有氧环境条件下,蛋白质中暴露的巯基会被氧化形成蛋白交联[17]。因此,经过超微粉碎处理,小麦面筋蛋白中部分埋藏(或包裹)的巯基暴露出来,但在与空气中氧的接触过程中,暴露的巯基又被氧化形成二硫键,导致不同粒度的小麦面筋蛋白超微粉体随着粒度的减小,其暴露巯基数量呈先增后减的变化规律[18]。
注:小写字母表示差异显著P<0.05,余同。图1 超微粉碎小麦面筋蛋白巯基含量变化
2.3 超微粉碎处理对小麦面筋蛋白二级结构的影响
超微粉碎小麦面筋蛋白二级结构的变化分析结果列于表2。分析结果显示,经过超微粉碎处理后,小麦面筋蛋白二级结构发生了不同程度的变化。与对照样品A相比,超微粉碎后小麦面筋蛋白的β-折叠、无规卷曲结构显著增加,α-螺旋和β-转角结构显著减小(P<0.05)。经过超微粉碎后处理后,小麦面筋蛋白的α-螺旋与β-折叠的比值减小,表明小麦面筋蛋白分子的柔性增加[19]。有研究表明,超微粉碎处理过程中,粉体颗粒受到碰撞、剪切、摩擦等机械力的作用后可能诱发化学反应,产生机械力化学效应,导致颗粒结构及其表面物理化学性质发生显著变化[20]。因此,小麦面筋蛋白粉体经过超微粉碎处理后,其二级结构发生了显著变化。
2.4 超微粉碎处理对小麦面筋蛋白溶解度的影响
从图2可以看出,超微粉碎处理对小麦面筋蛋白的溶解度影响显著(P<0.05)。研究结果显示,当溶液pH值<5时,随着小麦面筋蛋白粉体粒度的减小,其溶解度整体呈现明显增加的趋势,但变化无明显的规律性,这可能与蛋白所带电荷产生的静电推斥作用和粉体受粒度变化而产生的颗粒间相互团聚作用的竞争有关[21];当溶液pH值≥5时,随着小麦面筋蛋白粉体粒度的减小,比表面积增加,其溶解度显著增加,但随着粉体粒度进一步减小,面筋蛋白粉体颗粒之间因发生-SH/-SS-交换而聚合,形成不溶的高分子聚合物,导致其溶解度显著下降[22]。
表2 超微粉碎处理前后小麦面筋蛋白二级结构变化
注:小写字母表示5%水平上的差异显著性。
图2 超微粉碎小麦面筋蛋白溶解度变化
2.5 超微粉碎处理对小麦面筋蛋白起泡性的影响
小麦面筋蛋白经超微粉碎处理后,起泡性发生了明显的变化。从图3分析结果可以看出,超微粉碎后小麦面筋蛋白的起泡能力和泡沫稳定性均得到显著改善,起泡能力由对照样品A的136%增加到196%(E);对照样品A的泡沫稳定性为34%,经超微粉碎后最大可达54%(E)。但是,随着小麦面筋蛋白粉体粒度的进一步减小,E、F和G之间的起泡能力和泡沫稳定性均无显著变化(P<0.05)。
图3 超微粉碎小麦面筋蛋白起泡性变化
2.6 超微粉碎处理对小麦面筋蛋白乳化性的影响
蛋白质的乳化性受自身溶解度、表面疏水性、二硫键和游离巯基及表面电荷分布等因素的影响[23]。Yalcin等[14]的研究表明,在中性pH条件下,小麦面筋蛋白的乳化活性和乳化稳定性均较低。因此,本研究在pH 4.0条件下,分析超微粉碎对小麦面筋蛋白乳化特性的影响规律。图4列出了在pH 4.0下超微粉碎小麦面筋蛋白的乳化活性和乳化稳定性变化情况。随着粉体粒度的减小,A、B、C三者之间的乳化活性和乳化稳定性并无显著变化;但随着粉体粒度的进一步减小,小麦面筋蛋白的乳化活性和乳化稳定性均显著提高(P<0.05)。G的乳化活性最高,与对照样品A相比,增加了6%;乳化稳定性则由对照样品A的12.7%增加到样品F的13.8%。
图4 超微粉碎小麦面筋蛋白乳化性变化
3 讨论
在超微粉碎过程中,粉碎腔内强大的气流使小麦面筋蛋白颗粒、腔壁之间发生剧烈碰撞、摩擦,导致小麦面筋蛋白二级结构发生改变。蛋白质二级结构的变化直接影响到维持蛋白质高级结构的氢键、二硫键、疏水键等作用力[2]。FTIR分析结果显示,超微粉碎后,小麦面筋蛋白的α-螺旋和β-转角结构减小,相应地转化为β-折叠或无规卷曲结构,分子柔性增加。因此,小麦面筋蛋白分子之间形成二硫键的可能性增加[24],这与超微粉碎后小麦面筋蛋白巯基含量随粒度变化的分析结果吻合,即超微粉碎后小麦面筋蛋白的总游离巯基含量随粒度的减小显著地递减。超微粉碎处理暴露了埋藏(或包裹)在蛋白分子内部的巯基,使大量巯基暴露于有氧环境中,从而使大量氧气与小麦面筋蛋白暴露的巯基在气流粉碎腔内充分接触。当2个半胱氨酸残基接近并适当定向时,分子氧可将巯基氧化形成二硫键,导致小麦面筋蛋白总巯基含量的降低,二硫键的形成有助于稳定蛋白质的折叠结构[25]。
游离巯基基团和二硫键是植物蛋白中重要的功能基团,其含量变化可反映蛋白的变性程度,对蛋白的功能性质有重要影响[26]。超微粉碎后,小麦面筋蛋白的溶解度得到一定改善,这是由于超微粉碎可以显著增加其表面积,暴露出更多的极性基团,增加其与水的结合点[27]。但是,随着粒度的进一步减小,小麦面筋蛋白通过-SH/-SS-相互转化发生聚合,形成不溶的面筋蛋白大聚体,从而导致溶解度下降。蛋白质的溶解度对其乳化性、起泡性等功能特性具有重要影响。小麦面筋蛋白经过超微粉碎处理,随其粒度的减小,有助于改善气-水/油-水界面的相互作用,提高其溶解性,进而改善小麦面筋蛋白的起泡性和乳化性[28]。
4 结论
超微粉碎处理可以显著提高小麦面筋蛋白分子的柔性,暴露出更多的埋藏(或包裹)于小麦面筋蛋白内的巯基,在有氧环境中促使暴露的巯基部分氧化成分子内或分子间二硫键,进而影响到小麦面筋蛋白的溶解度、起泡性和乳化性等功能特性的变化。当小麦面筋蛋白粉体粒度(D50)达到5 μm左右时,可显著改善其乳化性、起泡性。因此,工业生产中可以通过采用超微粉碎处理的方法来改善小麦面筋蛋白的溶解度、乳化性和起泡性等功能特性,提高其工业应用价值。
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Effects of Superfine Grinding Treatment on the Properties of Wheat Gluten
Guo Wuhan Guan Erqi Bian Ke
(College of Food Science and Technology, Henan University of Technology, Zhengzhou 450001)
The objective of this study is to investigate the effects of superfine grinding treatment on the structure and functional properties of gluten protein, to provide a theoretical basis for exploiting the application field of wheat gluten. Wheat gluten as raw material was comminuted into 6 different meshes by a airflow pulverization instrument, and the effects of superfine grinding treatment on gluten protein sulfhydryl content, secondary structure, solubility, foaming, emulsifying were researched using fourier transform infrared spectroscopy, uv-visible spectrophotometer, as well as conventional chemical analysis method. Results showed that, after superfine grinding treatment, wheat gluten powder particle size (D50) was decreased from 109.35 μm to 3.60 μm. With decreasing particle size of wheat gluten powder, total sulfhydryl content decreased significantly, and exposed sulfhydryl content increased firstly and then decreased. FTIR analysis showed that after superfine grinding treatment, β-sheet structure, random coil increased significantly, and flexibility of gluten improved. Protein functional properties analysis showed that the powder particle size decreases, the solubility of gluten significant changed, foaming and emulsifying properties were significantly improved, after superfine grinding treatment. Among them, the foaming ability, foam stability, emulsifying activity and emulsion stability increased by 50%, 20%, 6%, 1.1%, respectively. Therefore, superfine grinding treatment has a significant influence on the structure and function of wheat gluten. When the wheat gluten size was decreased to about 5 μm, its sulfhydryl content, solubility changed significantly, and protein flexibility, emulsifying and foaming properties improved significantly.
wheat gluten, superfine grinding, sulfydryl, secondary structural, functional properties
河南工业大学基本科研业务专项(2014YWQQ01),国家现代农业(小麦)产业技术体系建设专项(CARS-03),粮食公益性行业科研专项经费项目(201313005)
2015-10-20
郭武汉,男,1988年出生,硕士,谷物加工技术与理论
卞科,男,1960年出生,教授,谷物化学及农产品贮藏与加工工程
TS210.1
A
1003-0174(2017)05-0013-06