蜂蜜中蜜蜂美洲幼虫腐臭病的检测方法研究

杨东来，刘 丹，王 旭，彭 菲

（满洲里出入境检验检疫局，内蒙古满洲里 021400）

蜂蜜中蜜蜂美洲幼虫腐臭病的检测方法研究

杨东来，刘 丹，王 旭，彭 菲

（满洲里出入境检验检疫局，内蒙古满洲里 021400）

美洲幼虫腐臭病是世界上最严重的蜜蜂病害之一，病原体是幼虫芽孢杆菌。在蜂蜜中检测幼虫芽孢杆菌的有效方法很少。本研究将微生物培养法和PCR法结合，改进了对病原菌的培养和分离，再用PCR法进行定性鉴别，从而降低了检出限，提高了检测的准确性。

美洲幼虫腐臭病；幼虫芽孢杆菌；蜂蜜；检测；微生物培养；PCR法

美洲幼虫腐臭病[1-2]（American foulbrood disease，AFB）是世界上最严重的蜜蜂病害之一，主要感染蜜蜂幼虫。幼蜂一旦感染AFB后，如果没有适当的治疗，感染的蜜蜂就会很快死亡，而且还会扩散到整个蜂群，甚至感染其他有过接触的蜂群，导致整个蜂群死亡。AFB的病原是幼虫芽孢杆菌（Paenibacillus larvae），主要感染西方蜜蜂，蜜蜂幼虫通过食入污染病原的食物而感染[3-4]。其对1日龄的蜜蜂幼虫的感染率很高，对2日龄的幼虫感染率较低，对3日龄以上及成虫不具有感染性。蜜蜂幼虫感染后，症状表现为体表颜色由原来的白色逐渐变黑褐色，身体脱水，体表有微小的鳞片状物，最后干枯，紧贴在蜂巢房壁上。幼虫芽孢杆菌只有在芽孢状时才具有感染性，其他的营养体不具有感染性。由于具有芽孢这种特殊结构，使感染性的幼虫芽孢杆菌具有很强的生存能力，对高温、酸碱和化学消毒剂有很强的耐受性。

目前检测幼虫芽孢杆菌的方法有症状诊断法、微生物学诊断法、生化诊断法、牛乳诊断法、PCR诊断法等[2,4-5]。其中PCR诊断法对幼虫芽孢杆菌的诊断快速、准确，灵敏度高，是当前的主要诊断手段。

上述方法主要检 测对象是蜜蜂的个体，如PCR法是从蜜蜂身体中提取DNA来确定有没有幼虫芽孢杆菌特定基因片段。这些方法用于检测蜂蜜中的幼虫芽孢杆菌有很大的局限性。有关把蜂蜜作为对象来检测幼虫芽孢杆菌的方法较少，主要原因在于蜂蜜较为粘稠，成分复杂，芽孢分布不均匀，幼虫芽孢杆菌不能很好分离收集，使得检测结果不稳定，误检率高。

本检测法是在原有方法的基础上，根据蜂蜜样品的特殊性，改进病原菌的培养分离方法，将微生物诊断法和PCR法[5-6]结合到一起，提高检测的精度和准确性。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株。Paenibacillus larvae，编号为ATCC 9545，购自ATCC（美国菌种保藏中心）。

1.1.2 主要试剂。培养基，购自北京陆桥；快速DNA提取扩增试剂盒，编号KG201，购自上海生工；引物购自上海生工，正向：5'-CTT GTG TTT CTTT CGG GAG AGG CCA-3'，反向：5'-TCT TAG AGT GCC CAC CTC TGCG-3'，PCR产物大小为1 106 bp。

1.1.3 主要设备。PCR仪（Biometra TADVANCED）、凝胶成像系统（美国伯乐 Gel Doc XR+）

1.2 试验方法

1.2.1 样品前期处理。取蜂蜜样品100 g，45 ℃水浴20 min；待蜂蜜的粘稠度降低，搅拌均匀，从中称取10 mL蜂蜜样品加入10 mL无菌生理盐水；涡旋混匀，80 ℃水浴震荡20 min。

1.2.2 病原菌的培养。培养基为脑心浸液培养基（BHI琼脂培养基），高压灭菌后放冷到90 ℃左右；取处理的蜂蜜样品1 mL加入到培养平板中，倒入BHI琼脂培养基15 mL，摇匀；凝固后，放37 ℃培养箱培育72 h，观察培养皿中菌落的生长情况。

1.2.3 菌落收集。在培养平板中有菌落生长时，观察菌落特征，收集疑似菌落。幼虫芽孢杆菌的菌落特征是颜色灰白，表面粗糙，凹凸不平，菌落边缘不光滑不整齐，并且菌落具有迁移性，随培养时间不同位置会发生游走[4]。对疑似幼虫芽孢杆菌菌落，用接种针或小药匙将菌落挑起放入离心管中，加入2 mL无菌生理盐水，涡旋混匀。

1.2.4 PCR检测。取上步菌液200 µL，按照快速DNA提取扩增试剂盒操作说明，提取DNA，加入引物，对特异基因进行扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳，用紫外凝胶成像系统观察有无目的条带。具体参数为反应体积20 µL，反应循环：94 ℃/3 min→（94 ℃/30 s→55 ℃/30 s 72/1 min）35 个循环→72 ℃/5 min。PCR反应结束后，取5 µL产物，用于琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结果

如果1.1.2中的培养平板没有菌落生长，判断为没有检测到幼虫芽孢杆菌，美洲幼虫腐臭病为阴性；如果培养平板中有菌落生长，则进行1.2.3和1.2.4中的操作。如果在琼脂糖凝胶电泳结果中的1 106 bp处有条带，则判断为检测到幼虫芽孢杆菌，如果没有，则判断为没有检测到幼虫芽孢杆菌。结果发现，泳道1~3在1 106 bp处有目的条带，为阳性，同样泳道6~8为阳性，其余泳道没有目条带，为阴性（图1）。

图1 PCR琼脂糖凝胶电泳结果

3 讨论分析

本检测方法是将微生物培养法和PCR法结合到一起，很大程度地提高了检测的精确性和准确性。微生物培养法也是鉴别幼虫芽孢杆菌的重要方法，单纯用微生物培养法检测，样品培养后很容易出现杂菌，这将增加鉴别的难度。另外国外有文献报道在蜂蜜中发现有18种芽孢杆菌的和幼虫芽孢杆菌形态学相近[7]，镜检鉴别很难区分，所以只用微生物法培养很容易出现误检。

随着PCR技术的发展，PCR技术成为了生物学鉴定的重要方法，也是当前幼虫芽孢杆菌的主要检测方法。但是直接以蜂蜜为样本检测幼虫芽孢杆菌在实际操作中却有这很大的局限性，最大的问题是当芽孢在蜂蜜中浓度小于一定程度时无法保证有效的提取DNA，但可通过添加阳性菌液对照试验来检测本文方法和直接提取DAN法这两种方法的灵敏度高低。把幼虫芽孢杆菌菌液不同梯度稀释，80℃水浴震荡20 min，用琼脂平板法[8]计数确定菌液的浓度，然后添加到无菌蜂蜜样品中，计算蜂蜜中幼虫芽孢杆菌的浓度，得到含有不同浓度幼虫芽孢杆菌的蜂蜜样品，用两种方法检测的结果如图1。泳道6~10为直接在蜂蜜中提取的DNA和 PCR后琼脂糖凝胶电泳结果。只有当蜂蜜中幼虫芽孢杆菌的浓度大于500个/mL时才能准确的检测到幼虫芽孢杆菌；当蜂蜜中幼虫芽孢杆菌数量低于这个浓度时，检测结果不稳定，也就检测不到幼虫芽孢杆菌。泳道1~5为本文的检测方法先微生物培养、PCR，再琼脂糖凝胶电泳。当蜂蜜中幼虫芽孢杆菌的数量大于100个/mL时检测结果准确；当小于这个浓度时，检测结果不稳定，同样也就检测不到幼虫芽孢杆菌。

本检测方法改进了微生物的培养方法，增加了取样量（可以在微生物培养环节做多平行），可有效分离扩增幼虫芽孢杆菌。该方法利用PCR对培养后的菌落进行鉴定，有效降低了幼虫芽孢杆菌的误检率，降低了检测浓度，保证了幼虫芽孢杆菌检测结果的准确率。

[1] 陈胜禄.中国养蜂学[M].北京：中国农业出版社，2001：592-593.

[2] New Antibiotic For AFB[J]. Bee Culture，2012：75.

[3] FRIES I，LINDSTROM A，KORPELA S. Vertical transmission of American foulbrood in honey bees[J]. Veterinary Microbiology，2006，114：269-274.

[4] 农业部兽医局，中国动物卫生与流行病学中心. 陆生动物诊断试验和疫苗手册：哺乳动物、禽鸟与蜜蜂[M]. 5版.北京：中国科技出版社，2007：985-987.

[5] 农业部. 蜜蜂幼虫腐臭病诊断技术规范：NY/T 1951—2010[S]. 北京：中国标准出版社，2010.

[6] PIICCINI C，ALESSANDRO B D，ANTUNEZ K. Detection of Paenibacillus larvae subspecies larvae spores in naturally infected bee larvae and artificially contaminated honey by PCR[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology，2002，18（8）：761-765.

[7] ANTUNEZ K，ALESSANDRO B D，CORBELLA E，et al. Paenibacillus larvae spores in honey samples from Uruguay：a nationwide survey[J]. Invertebrate pathology，2004，86：56-58.

[8] 卫生部. 食品卫生微生物学检验 菌落总数测定：GB 4789.2—2010[S]. 北京：中国标准出版社，2010.

（责任编辑：朱迪国）

Study on the Detection Method of American Foulbrood in Honey

Yang Donglai，Liu Dan，Wang Xu，Peng Fei
（Manzhouli Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Manzhouli，Inner Mongolia 021400）

American foulbrood is one of the most severe diseases of honeybee. The causative agent isPaenibacillus larvae. There are few effective methods to detectBacillusin honey. In this study，microbial culture method and PCR method were combined to improve the cultivation and isolation of pathogenic bacteria，and then qualitative identif i cation was carried out by PCR method，in order to reduce the detection limit and to improve the accuracy of detection.

American foulbrood；Paenibacillus larvae；honey；detection；microbial cultivation；PCR

S851.34

：B

：1005-944X（2017）07-0105-03

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.07.029