增殖因子对嗜酸乳杆菌液态培养的影响

张超凤，李情敏，严美婷，杜霞，陈卫平，张凤英

（江西农业大学食品科学与工程学院，江西南昌330045）

增殖因子对嗜酸乳杆菌液态培养的影响

张超凤，李情敏，严美婷，杜霞，陈卫平，张凤英*

（江西农业大学食品科学与工程学院，江西南昌330045）

对嗜酸乳杆菌培养基中的碳源和增殖因子进行优化，以增加菌体的数量。先从碎米粉、玉米、小麦等原料的水解糖液中，选出最佳的碳源及最佳浓度。然后用土豆汁、番茄汁、麦芽汁、白萝卜汁、乳糖、大豆分离蛋白等6种物质作为增殖因子，采用单因素试验，选出效果较好的增殖因子，继而采用正交试验以确定最佳的增殖因子组合，结果表明：最佳碳源及浓度为4°Bx碎米水解糖液；最佳增殖因子组合为：6%麦芽汁，0.9 g/100 mL乳糖，7%白萝卜汁，在此条件下液态发酵活菌数可达6.2×109cfu/mL。

嗜酸乳杆菌；液态发酵；增殖因子；活菌数

嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）是一种重要的乳杆菌属益生菌，属于革兰氏阳性杆菌[1-3]，杆的末端呈圆形，不形成色素、过氧化氢酶阴性、不能还原硝酸盐[4-5]。可作为生产用理想的饲料添加剂菌株[6]。适合生存在37℃的微酸性环境中，主要存在于人和动物的肠道和口腔中。乳酸菌的大量生长繁殖维持了肠道菌群的平衡，起到了整肠作用[1]，抑制肠道不良微生物的生长和繁殖，阻止致病菌的入侵和定殖，从而调整菌群之间的关系，维持和保证菌群最佳优势组合以及这种组合的稳定性。乳酸菌发酵产生的乳酸，有助于消化[7-10]。嗜酸乳杆菌分泌的蛋白酶，能够促进蛋白质的消化和吸收。同时，嗜酸乳杆菌在肠道内定殖，能激活机体巨噬活性，诱发体内特异性及非特异性免疫反应，提高人和动物的抗感染能力[11-13]。此外，嗜酸乳杆菌能通过改善肠道菌群，抑制致癌物质的生成，其本身及代谢产物还能活化免疫功能，抑制体内癌细胞的形成和增殖。近年来对嗜酸乳杆菌的应用越来越广，然而国内对嗜酸乳杆菌的研究主要集中在应用方面，而基础研究却很少[14-17]。但不管是菌剂的开发还是菌体的分离培养、发酵剂的制备等，都需要良好的增菌培养基，使嗜酸乳杆菌得以大量增殖。

因而，为了增加嗜酸乳杆菌的活菌数，我们研究了在厌氧液态发酵条件下，选择出适于工业生产的嗜酸乳杆菌碳源，并通过研究不同增殖因子对嗜酸乳杆菌液态发酵的影响，确定出能提高嗜酸乳杆菌产量、降低嗜酸乳杆菌生产成本、提高资源利用率的最佳增殖因子组合，为嗜酸乳杆菌工业化生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）：于中国普通微生物菌种保藏管理中心（China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC）购买。

培养基：

种子液培养基：液态MRS培养基；菌落计数培养基：固态MRS培养基。

基础培养基：20 g豆粕（20 g豆粕粉加水煮沸20 min，过滤）15 g葡萄糖（或最佳碳源），硫酸镁 0.5 g，硫酸锰 0.25 g，乙酸钠 5 g，水 1 000 mL（pH 5.5～6.0）。

主原料：

土豆、番茄、白萝卜、麦芽：购于江西农业大学的菜市场；大豆分离蛋白（食品级）：河南中偌生物科技有限公司；乳糖（分析纯）：天津市永大化学试剂开发中心。

1.2 仪器与设备

WFZ UV-2100紫外可见分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司；WJ-LCQ二氧化碳培养箱：上海跃进医疗器械厂；SYQ-DSX-280B手提式不锈钢压力蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；ZD-8802摇床：江苏太仓华利实验设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 分析方法

紫外分光光度计法：在600 nm波长下测定嗜酸乳杆菌的OD值。

稀释涂布平板法进行菌落计数。

1.3.2 方法

1.3.2.1 水解糖液的制备

将玉米、碎米、小麦磨粉。分别加入85%的水充分混匀，置水浴锅中加热至100℃，使其彻底糊化。待温度降至80℃，加入适量α-淀粉酶混匀保温20 min，使淀粉液化。再将温度升至100℃保温灭酶10 min。继续降温至约60℃时，加入适量β-淀粉酶，混匀，在60℃恒温条件下保温约6 h，使淀粉充分糖化。

1.3.2.2 增殖因子的处理

土豆汁、番茄汁、白萝卜汁：分别将土豆、番茄、白萝卜新鲜榨原汁，用纱布过滤后灭菌，备用。

麦芽汁：加入75%的水与麦芽混合煮沸20 min，冷却过滤灭菌，备用。

1.3.2.3 碳源及浓度的确定

以各水解糖液和葡萄糖为碳源，最佳碳源浓度分别为 1、2、3、4、5、6 °Bx，接种 5%的种子液，在 37 ℃，5%CO2的条件下培养24 h测吸光度，每个碳源浓度做3个平行，以确定最佳碳源浓度。

1.3.2.4 增殖因子单因素试验

将各个增殖因子以不同含量（除乳糖与大豆分离蛋白其它均为体积分数）[白萝卜汁（%）：0、2、4、6、8；番茄汁（%）：0、2、4、6、8；土豆汁（%）：0、2、4、6、8；麦芽汁（%）：0、2、4、6、8；乳 糖（g/100 mL）：0、0.5、0.7、0.9、1.1；大豆分离蛋白（g/100 mL）：0、0.2、0.4、0.6、0.8]加入优化后的基础培养基中，培养测其吸光度，确定最佳的增殖因子及其最佳浓度。

1.3.2.5 增殖因子正交试验

根据增殖因子对目的菌的生长促进效果以及增殖因子经济性等条件选出最合适的3种增殖因子，采用L9（34）正交表进行正交试验，试验因素水平表如表1，并通过分析试验结果得出最佳增殖因子组合。

表1L9（34）正交试验因素水平表Table 1 Factors and levers of the L9（34）orthogonal experiments

1.3.2.6 生长曲线绘制

用最终确定的增殖培养基培养嗜酸乳杆菌，每4小时测一次吸光度，连续测定48 h，以OD值为纵坐标，发酵时间为横坐标作出嗜酸乳杆菌生长曲线。

2 结果与分析

2.1 碳源对嗜酸乳杆菌生长的影响

不同碳源对嗜酸乳杆菌生长的影响如图1所示。

图1 不同碳源对嗜酸乳杆菌生长的影响Fig.Effect of different carbon source on the growth of Lactobacillus acidophilus

乳杆菌属对不同种类糖的代谢顺序为：葡萄糖>果糖>麦芽糖>半乳糖>蔗糖>甘露糖>核糖>乳糖>纤维二糖[18]，由图1可知3种水解糖液作为碳源时，嗜酸乳杆菌的长势都较葡萄糖为碳源时更好，而碎米水解糖液效果最好。可能是因为其水解糖液中含其它促生长因子，且碎米的价格较便宜，在工业化生产中，既能为企业节省生产成本，还能充分利用资源，所以选择用碎米粉水解液代替葡萄糖作为碳源进行工业生产嗜酸乳杆菌。

2.2 碎米水解液糖含量对嗜酸乳杆菌生长的影响

碎米水解液糖含量对嗜酸乳杆菌生长的影响如图2所示。

图2 碎米水解液糖含量对嗜酸乳杆菌生长的影响Fig.2 Effects of different sugar content in broken Rice Hydrolyzate on Lactobacillus acidophilus Growth

由图2可知，随着培养基中糖含量的增加，OD值出现先增大后减小的现象，当碳源不足时，随着浓度的增加，菌体迅速繁殖，但浓度过高会造成细胞脱水而死亡而抑制菌体的生长。当碳源浓度为4°Bx时，嗜酸乳杆菌的生长状况最好，OD值（稀释20倍）达到0.364。

2.3 增殖因子对嗜酸乳杆菌生长的影响

2.3.1 白萝卜、番茄汁、土豆汁、麦芽汁作为增殖因子对嗜酸乳杆菌的影响

白萝卜、番茄汁、土豆汁、麦芽汁浓度对嗜酸乳杆菌生长的影响如图3所示。

图3 蔬菜汁浓度对嗜酸乳杆菌生长的影响Fig.3 Effect of different concentration of vegetables juice on the growth of Lactobacillus acidophilus

由图3可知白萝卜汁对嗜酸乳杆菌的生长促进比较明显，麦芽汁对嗜酸乳杆菌的生长有一定的促进作用，番茄汁和土豆汁对嗜酸乳杆菌的增殖效果不太明显，可能是因为白萝卜汁中含有维生素A、胡萝卜素、维生素C等多种维生素以及钙、钾、镁等多种金属元素，从而促进了嗜酸乳杆菌的生长。

2.3.2 乳糖作为增殖因子对嗜酸乳杆菌的影响

乳糖浓度对嗜酸乳杆菌的影响如图4所示。

图5 大豆分离蛋白浓度对嗜酸乳杆菌生长的影响Fig.5 Effect of different concentration of soy protein isolate on the growth of Lactobacillus acidophilus

由图4可知，乳糖对嗜酸乳杆菌的增殖效果比较明显，随着浓度的增加增殖效果也越来越好，当乳糖的浓度为0.9 g/mL时，增殖效果最好，超过这一浓度后，增殖效果反而下降，为此我们选用0.9 g/mL的乳糖作为增殖浓度。

2.3.3 大豆分离蛋白作为增殖因子对嗜酸乳杆菌的影响

大豆分离蛋白浓度对嗜酸乳杆菌的影响如图5所示。

图4 乳糖浓度对嗜酸乳杆菌生长的影响Fig.4 Effect of different concentration of lactose on the growth of Lactobacillus acidophilus

由图5可知，大豆分离蛋白对嗜酸乳杆菌的生长促进作用很不明显，各浓度间影响差异也不明显，因此对其不予考虑。

通过比较各种增殖因子的最佳增殖效果，选出对嗜酸乳杆菌的生长有较显著影响的3种增殖因子，即白萝卜汁、麦芽汁、乳糖作为增殖因子做正交试验。

2.4 增殖因子正交试验

白萝卜汁、麦芽汁、乳糖作为增殖因子对嗜酸乳杆菌影响的正交试验结果见表2。

表2 增殖因子正交试验结果Table 2The result of L9（34）orthogonal experiments

续表2 增殖因子正交试验结果Continue table 2The result of L9（34）orthogonal experiments

通过DPS数据处理软件采用Duncan法对正交试验结果进行分析，得出表3。

表3 增殖因子正交试验方差分析表Table 3The variance analysis of L9（34）orthogonal experiments

从表3可知A（麦芽汁）、C（白萝卜汁）都对嗜酸乳杆菌的生长促进效果极显著，它们的P值＜0.01，其中B（乳糖）0.01＜P＜0.05，说明其效果显著。

表4 增殖因子的多重比较结果Table 4 The results of multiplication factors

由表4的多重比较结果可知，最优组合为A2B1C3，即6%麦芽汁，0.8 g/mL乳糖，7%白萝卜汁。在此配方下液态发酵嗜酸乳杆菌，测OD值和对菌数进行计数，并与9个处理中最高的一组即A2B2C3相比。结果表明在A2B1C3条件下培养的嗜酸乳杆菌的OD值和菌数均低于A2B2C3的组合，在A2B2C3的组合条件下的培养基OD值为0.449，菌数经计数可达6.2×109cfu/mL，且与未经优化的时5.3×108cfu/mL相比，菌数高很多。由此确定最终的最优增殖因子组合为A2B2C3，即6%麦芽汁，0.9 g/mL乳糖，7%白萝卜汁。

2.5 生长曲线的绘制

嗜酸乳杆菌生长曲线如图6所示。

图6 嗜酸乳杆菌生长曲线Fig.6 The growth curve of Lactobacillus acidophilus

从图6可看出0～8 h嗜酸乳杆菌处于适应期；8 h～24 h为对数期，这段时间内细菌数量大量增加；24 h～40 h左右则为稳定期，细菌数量变化不大，40 h时细菌数量达到最大，此时为收集细菌的最佳时间；40 h之后，开始进入衰亡期，细菌数量开始下降。

3 结论

本试验确定了嗜酸乳杆菌最佳碳源为碎米水解糖液，以及最佳浓度为4BX。为嗜酸乳杆菌的工业化生产中提供了一定的理论意义，不仅可以实现资源的有效利用，降低环境压力，还能节约生产成本。在以4°Bx碎米水解液的基础培养基中，加入增殖因子，进行单因素实验和正交试验分析，得出了有利于嗜酸乳杆菌生长的最佳增殖因子组合，即6%麦芽汁，0.9 g/100 mL乳糖，7%白萝卜汁。按以上配方液态发酵嗜酸乳杆菌的最高OD值（稀释20倍）可达到0.449，菌数经计数可达6.2×109cfu/mL，较基础培养基而言（5.3×108cfu/mL），菌数得到较大程度的增加，并利用优化后的培养基做嗜酸乳杆菌的生长曲线，得出40 h为菌体的最佳收集时间，这样为益生菌制剂研制前期（获得菌体）奠定了基础。

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Effect of Proliferation Factor on the Liquid Culture of Lactobacillus acidophilus

ZHANG Chao-feng，LI Qing-min，YAN Mei-ting，DU Xia，CHEN Wei-ping，ZHANG Feng-ying*
（College of Food Science and Engineering，Jiangxi Agricultural University，Nanchang 330045，Jiangxi，China）

To increase the number of Lactobacillus acidophilus，the best carbon source and optimize the breeding factors in the culture medium was chosen.From hydrolysised the broken rice，corn and wheat into sugar，elect the best carbon source and the best concentration.Then put the solidify，tomato juice，malt juice，white turnip juice，lactose，soy protein isolated as multiplication factor of substances，adopt single factor experiment，choose the multiplication factor with better effect，and then adopt orthogonal experiment to determine the best combinationofmultiplicationfactor，theresultsshowedthatthebestcarbonsourceandconcentrationfor4 °Bx broken rice hydrolyzed sugar liquid；best multiplication factor combination was：6%malt juice，0.9 g/100 mL lactose，7%white turnip juice，the living bacterium number coule be up to 6.2 × 109cfu/mL under this liquid fermentation condition.

Lactobacillus acidophilus；liquid state fermentation；multiplication factor；number of living bacterium

2016-09-20

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.14.038

张超凤（1991—），女（汉），在读硕士研究生，研究方向：食品微生物。

*通信作者：张凤英，女，研究员，硕士生导师，研究方向：农产品加工与贮藏。