超声波辅助提取玫瑰茄色素的工艺研究

王丽霞，王贤龙，王玉玲，潘一山，王少峰

（1.闽南师范大学生物科学与技术学院，福建漳州363000；2.漳州金三角生物科技有限公司，福建漳州363000）

超声波辅助提取玫瑰茄色素的工艺研究

王丽霞1，王贤龙1，王玉玲1，潘一山1，王少峰2

（1.闽南师范大学生物科学与技术学院，福建漳州363000；2.漳州金三角生物科技有限公司，福建漳州363000）

采用超微粉碎技术处理玫瑰茄干花萼。选取超声时间、超声温度、超声功率、液料比为自变量，花色苷含量为响应值，进行响应面优化设计。结果表明：玫瑰茄红色素适宜的提取工艺条件为：超声时间33.26 min，超声温度47.23℃，超声功率57.98%，液料比128.73∶1（mL/g），该试验条件下花色苷含量的预测值为4.66 mg/g。依据实际试验情况，将其修正为超声时间30 min、超声温度50℃，超声功率60%即120 W、液料比130∶1（mL/g），经验证此条件下花色苷实际提取量为4.63 mg/g，实际值接近理论预测值，说明响应面法优化玫瑰茄色素提取工艺参数的可行性。超声联合超微粉碎可以显著提高玫瑰茄红色素的提取率。

玫瑰茄色素；超微粉碎；超声波；提取

玫瑰茄（Hibiscus sabdariffa L.），又名山茄、苏丹红、美丽纳[1]，属锦葵科木槿属一年生草本植物[2]，广泛分布于热带、亚热带地区，在我国的广东、广西、福建、云南、台湾等地均有栽培。玫瑰茄含有丰富的蛋白质、有机酸、维生素C、多种氨基酸、大量的天然色素及多种矿物质[3]。具有很高的药用和食用价值，如：降血压[4]、抗肿瘤[5]、抗氧化[6]、护肝[7]、利尿通便[8]、保护心血管、降胆固醇[9]等。

其含有的花青素属酚类化合物中的类黄酮类，主要成分为飞燕草素-3-接骨木二糖苷、矢车菊-3-接骨木二糖苷[10]，是一种良好的氧游离基清除剂和脂质过氧化抑制剂，可有效清除超氧阴离子自由基和羟基自由基，也参与磷脂、花生四烯酸的新陈代谢和蛋白质磷酸化，保护脂质不发生过氧化损伤，是目前世界上发现的清除自由基最有效的物质之一[2]，具有一定的营养和药理作用，有较高的安全性能，而且具有抗突变、抗氧化、降血压、保护肝脏等保健功能，被广泛用于功能性食品和保健品的原料和着色，含花青素的植物提取物已被意大利、德国等国家的药典收载[10]。

玫瑰茄红色素作为天然的色素，应用越来越广泛，社会需求量很大。研究玫瑰茄花色素，有利于玫瑰茄的开发利用，提高其综合利用价值，带动产业经济发展。目前，关于玫瑰茄红色素的提取已有研究报道，提取方法为超声波辅助提取[1，11-13]、溶剂提取[14-15]及微波提取[16-17]，但是普遍存在提取率不高、提取时间长[14-16]、溶剂消耗大[14-15]等问题。本文采用超微粉碎辅助超声波提取玫瑰茄色素，通过响应面设计优化提取工艺参数，以期缩短提取时间、提高提取率。

1 材料与方法

1.1 材料

玫瑰茄干花萼：由漳州金三角生物科技有限公司提供；蒸馏水：闽南师范大学生物科学与技术学院生物实验教学示范中心。

1.2 仪器与设备

WK-150全新气流式超微粉碎机：欣镇企业有限公司；AR224CN电子天平：奥豪斯仪器（上海）有限公司；RO DI实验室超纯水机：上海和泰仪器有限公司；KQ-200VDE型双频数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；TGL-20M台式高速冷冻离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；UV-1750紫外分光光度计：厦门精艺兴业科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 玫瑰茄色素的提取工艺

将玫瑰茄干花萼放入超微粉碎机中粉碎，置于棕色瓶内在4℃条件下密封保存备用。称取适量玫瑰茄干花萼微粉加入蒸馏水于超声波清洗器中超声处理，提取液冷冻离心得上清液，测吸光度，计算色素提取率。

1.3.2 花色苷含量的测定

采用pH示差法测定提取花色苷的含量[18]。计算公式为：

式中：ρ为花色苷提取量，mg/g；A0、A1分别为 pH 1.0、pH 4.5时花色苷在520 nm波长处的吸光度；V为提取液总体积，mL；n为稀释倍数；M为矢车菊色素-3-葡萄糖苷的相对分子质量，449；ε为矢车菊色素-3-葡萄糖苷的消光系数，29 600；m为样品质量，g。

1.3.3 单因素试验

1.3.3.1 超声波时间对吸光度的影响

称取0.30 g玫瑰茄干花萼细粉5份于三角瓶中，加入蒸馏水50 mL，在30℃、超声波功率100%即200 W，超声时间分别为 20、30、40、50、60 min 的条件下提取玫瑰茄色素，冷冻离心，在520 nm波长下测定上清液吸光度[12]，计算花色苷含量。

1.3.3.2 超声波温度对吸光度的影响

称取0.30 g玫瑰茄干花萼细粉5份于三角瓶中，加入蒸馏水50 mL，设置超声波温度为30、40、50、60、70℃，超声时间30 min，超声波功率100%即200 W的条件下提取玫瑰茄色素，冷冻离心，在520 nm波长下测定上清液吸光度，计算花色苷含量。

1.3.3.3 超声波功率对吸光度的影响

称取0.30 g玫瑰茄干花萼细粉5份于三角瓶中，加入蒸馏水50 mL，超声波温度为50℃，分别在超声波功率为 80 W（60%）、100 W（50%）、120 W（60%）、140 W（70%）、160 W（80%）、180 W（90%）下，超声时间30 min的条件下提取玫瑰茄色素，冷冻离心，在520 nm波长下测定上清液吸光度，计算花色苷含量。

1.3.3.4 液料比的选择

称取0.50 g玫瑰茄干花萼细粉5份于三角瓶中，分别加入蒸馏水 40、50、60、70、80、90 mL 即液料比[蒸馏水用量（mL）∶玫瑰茄质量（g）]80 ∶1、100 ∶1、120 ∶1、140 ∶1、160 ∶1、180 ∶1。超声波时间 30 min，超声波温度50℃，超声波功率120 W（60%）的条件下提取玫瑰茄色素，冷冻离心，在520 nm波长下测定上清液吸光度，计算花色苷含量。

1.3.4 响应面试验设计

在单因素试验基础上，利用Design-Expert 8.05b软件进行Box-Behnken中心组合试验设计，优化玫瑰茄色素提取的最佳条件。以吸光值为指标，以超声波时间、超声波温度、超声功率、液料比4个因素为自变量，设计四因素三水平29个试验点的响应面分析试验，以得出最佳的提取工艺条件。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 超声波时间对吸光度的影响

超声波时间对花色苷提取量的影响见图1。

由图1可以看出，超声波时间在30 min以内，花色苷提取量随着时间的增加呈线性上升，说明色素在不断溶出，在30 min左右色素溶出完全，花色苷含量达到最大。之后，随时间增加花色苷提取量有所降低，这可能是由于超声波的震动能量改变了色素的结构[19]，也可能玫瑰茄色素不稳定，随着提取时间延长，空气的氧化作用使花色苷溶液分解褪色[20]。因此，超声时间选为30 min。

图1 超声波时间对花色苷提取量的影响Fig.1 Effects of ultrasonic time on the extraction yield of anthocyanins

2.1.2 超声波温度对吸光度的影响

超声波温度对花色苷提取量的影响见图2。

图2 超声波温度对花色苷提取量的影响Fig.2 Effects of ultrasonic temperature on the extraction yield of anthocyanins

由图2可以看出，作用温度在50℃以下，花色苷提取量随温度的增大而增大，在较低温度下，超声即可使玫瑰茄色素溶出，并且随超声温度升高色素溶出率增大，至50℃时达到最大，之后，随着作用温度的增大花色苷提取量反而降低，这是由于玫瑰茄色素在温度较高的情况下易变性而遭到破坏。且当温度超过60℃时，由于水分蒸发，液料比也会发生变化。因此，超声波温度选为50℃。此结论与涂佘财[11]、丁敬争等[12]的研究结果一致。

2.1.3 超声波功率对吸光度的影响

超声波功率对花色苷提取量的影响见图3。

由图3可以看出，随着超声波功率的增加，花色苷提取量呈先上升后下降趋势，当超声波输出功率为120 W（60%）时，花色苷提取量达最大值。这是由于超声波功率过大时，产生剧烈的振动，造成花色苷的糖苷分离[19]，即分子结构发生变化，从而导致花色苷含量降低。因此，超声波功率选为60%即120 W。

2.1.4 液料比对吸光度的影响

液料比对花色苷提取量的影响见图4。

图3 超声波功率对花色苷提取量的影响Fig.3 Effects of ultrasonic power on the extraction yield of anthocyanins

图4 液料比对花色苷提取量的影响Fig.4 Effects of solid/liquid ratio on the extraction yield of anthocyanins

由图4可以看出，随着液料比的增加，花色苷含量先增加，这是由于当溶剂较少时，玫瑰茄色素溶解不完全，随着液料比增加，色素能够充足的溶解在较多的溶剂中，但是当溶剂继续增加时，花色苷含量稍微降低，这可能是由于色素在高浓度时分子之间存在自聚作用使其比较稳定，而增加溶剂时，色素浓度降低以致色素分子之间的作用力变弱，其稳定性下降而容易分解[21]，最后花色苷含量趋于平衡，说明色素已经基本提取出来。因此，液料比选为140∶1（mL/g）。

2.2 响应面优化试验

2.2.1 响应面试验设计

在单因素试验的基础上，利用Design-Expert8.05b软件中的Box-Behnken设计，以超声波时间（A）、超声波作用温度（B）、超声波功率（C）、液料比（D）为考察因素，设置四因素三水平试验，每个因素低、中、高试验水平分别以-1、0、1进行编码，以提取的花色苷含量为响应值，优化玫瑰茄色素的超声波提取工艺参数。因素水平见表1。响应面试验结果见表2。

表1 响应面试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels used in response surface methodology

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Design and results of response surface analysis

2.2.2 回归方程的建立和显著性分析

以花色苷含量为响应值对表2的试验结果进行多元回归拟合，得花色苷含量对超声波时间（A）、超声波作用温度（B）、超声波功率（C）、液料比（D）的二元回归方程：

对该回归模型进行方差分析，结果见表3。

表3 回归方程方差分析Table 3 ANOVA of response surface model

从表4可知，模型P＜0.000 1，由此得出，响应回归模型达到了极显著的水平，其中，失拟项P＝0.136 2＞0.05不显著，说明模型拟合程度良好。模型校正系数R2＝0.981 7，模型修正系数 R2Adj＝0.963 3，C.V.%=0.47，说明响应值与因素之间建立的响应值可靠，可用于理论预测。回归系数显著性的检验可以表明，A、B、C、D、A2、B2、C2、D2、AB、BD 对花色苷含量有极显著的影响，AC、AD对花色苷含量有显著影响，其余不显著；4个因素对吸光度的影响大小为：D＞B＞A＞C，即液料比＞超声波温度＞超声波时间＞超声波功率。

2.2.3 三维响应曲面图分析

以花色苷含量为评价指标的回归模型的响应面图见图5～图10。

图5 超声波时间和超声波温度的交互作用对花色苷含量的影响Fig.5 Response surface plot showing the effects of ultrasonic time and temperature on the yield of anthocyanins

图6 超声波时间和超声波功率的交互作用对花色苷含量的影响Fig.6 Response surface plot showing the effects of ultrasonic time and power on the yield of anthocyanins

图7 超声波时间和液料比的交互作用对花色苷含量的影响Fig.7 Response surface plot showing the effects of ultrasonic time and liquid/material ratio on the yield of anthocyanins

由图5～图10可知，花色苷含量随着超声波时间、超声波温度、超声波功率、液料比的增大均呈先上升后下降趋势。其中超声波时间和超声波温度、超声波时间和超声波功率、超声波时间和液料比、超声波温度和液料比的交互作用对花色苷含量的影响显著，其他交互作用不显著。比较6组图可知，液料比影响较显著，表现为曲线较陡，花色苷含量随其数值变化而迅速变化；超声波功率影响最小，曲线比较平滑。

2.3 验证试验

图8 超声波温度和超声波功率的交互作用对花色苷的影响Fig.8 Response surface plot showing the effects of ultrasonic power and temperature on the yield of anthocyanins

图9 超声波温度和液料比的交互作用对花色苷含量的影响Fig.9 Response surface plot showing the effects of ultrasonic temperature and liquid/material ratio on the yield of anthocyanins

图10 超声波功率和液料比的交互作用对花色苷含量的影响Fig.10 Response surface plot showing the effects of ultrasonic power and liquid/material ratio on the yield of anthocyanins

为了进一步验证试验模型的准确性，采用Design Expert 8.05b软件对试验进行典型性分析，得到玫瑰茄色素提取的最优工艺参数为：超声波时间33.26 min，超声波温度47.23℃，超声波功率57.98%，液料比128.73∶1（mL/g）。花色苷含量的预测值为4.66 mg/g。考虑实际操作的可行性，将参数修正为：超声波时间30min，超声波温度50℃，超声波功率60%即120 W，液料比130∶1（mL/g）。并在此条件下，重复进行3次试验，测得花色苷含量的平均值为4.63 mg/g，与预测值较接近，说明响应面法优化玫瑰茄色素提取工艺参数的可行性。曾哲灵等[15]采用40%乙醇提取1.52h，得花色苷含量为4.876 mg/g，相比而言，本文采用超微粉碎辅助超声波联合提取玫瑰茄红色素，直接以水为溶剂，提取时间30 min，色素提取率达到4.63 mg/g，避免了使用乙醇等溶剂，提取时间短，提取率高。

3 结论

通过单因素试验和响应面优化分析，确定玫瑰茄色素提取的最佳工艺条件为：超声波时间30 min，超声波温度50℃，超声波功率60%即120 W，液料比130∶1（mL/g）。影响超声波提取的主次因素依次为液料比、超声波温度、超声波时间和超声波功率。超声波联合超微粉碎可以显著提高玫瑰茄红色素的提取率。

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Study on Ultrasonic-assisted Extraction of Pigment from Roselle

WANG Li-xia1，WANG Xian-long1，WANG Yu-ling1，PAN Yi-shan1，WANG Shao-feng2
（1.Department of Biology Science and Technology，Minnan Normal University，Zhangzhou 363000，Fujian，China；2.Zhangzhou Gold Saga Bio-technology CO.，LTD.，Zhangzhou 363000，Fujian，China）

Roselle dried calyx was treated by ultrafine comminution.Ultrasonic time，temperature，power and the ratio of liquid to material were selected as independent variables.The extraction yield of anthocyanins was selected as response value to conduct the optimization of response surface design.The optimum conditions of extraction obtained by response surface methodology were as followed：ultrasonic time of 33.26 min，ultrasonic temperature at 47.23℃，ultrasonic power of 57.98%，and liquid/material ratio of 128.73 mL/g.Under these conditions，the theoretic anthocyanins yield reached 4.66 mg/g.According to the actual experiments，the optimum theoretic parameters were modified as：ultrasonic time 30 min，ultrasonic temperature 50℃，ultrasonic power 60%，namely 120 W，and liquid/material ratio 130∶1（mL/g），and the actual extraction rate of anthocyanins was 4.63 mg/g，which was close to the predicted value.The results showed that the response surface method to optimize the ultrasonic-assisted extraction of roselle pigment was feasible.Ultrasonic and ultrafine comminution had a significant effect on extraction ratio of roselle pigment.

roselle pigment；ultrafine comminution；ultrasonic；extraction

2016-12-16

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.14.009

福建省高校科技计划重点项目（产学研项目）（2015N5003）

王丽霞（1979—），女（汉），副教授，博士，从事农产品加工、多糖结构与功能相关性等方面的研究。