响应面法优化田艾中总黄酮的提取工艺研究

张玲，梁妍，叶日清，张钟

（1.广东石油化工学院广东高校果蔬加工与贮藏工程技术开发中心，广东茂名525000；2.广东石油化工学院环境与生物工程学院，广东茂名525000）

响应面法优化田艾中总黄酮的提取工艺研究

张玲1，2，梁妍2，叶日清2，张钟1，2

（1.广东石油化工学院广东高校果蔬加工与贮藏工程技术开发中心，广东茂名525000；2.广东石油化工学院环境与生物工程学院，广东茂名525000）

以田艾绒为原料，采用微波辅助乙醇法提取田艾中总黄酮。在单因素试验基础上，选择乙醇体积分数、微波功率、微波时间为自变量，总黄酮得率为响应值，采用响应面法中的Box-Behnken模型对田艾中总黄酮提取工艺进行优化。结果表明，最佳提取工艺条件如下：料液比为1∶50（g/mL），预浸时间为30 min，乙醇体积分数为20%，微波功率为350 W，微波时间为67 s，此条件下田艾总黄酮的实际得率为23.60 mg/g。

田艾；总黄酮；提取；响应面

田艾又名白头翁，属菊科艾属植物，人们经常摘取来制作饼等糕点食用，以达到避邪气、驱寒毒的效果；另据《食物本草》介绍，田艾还具有祛湿，暖胃，清肠等功效。现代研究表明，艾属植物大多具有多种生物活性和药理功能，这些作用使其在医药、食品、化妆品等工业中应用广泛。黄酮类化合物是植物中广泛存在的一类活性物质，具有抗癌防癌、抗菌杀菌、改善心血管功能、延缓衰老、降血脂血压等功效[1]。黄酮类化合物在人体内不能直接合成，从植物中提取黄酮类化合物是人类获得酮类化合物的主要方式[2]。

微波是一种频率范围从300 MHz至300 GHz的非电离电磁能量[3]，微波辅助提取技术与传统提取技术相比，具有选择性高、操作时间短、溶剂消耗量少、有效成分得率高、不产生噪声、产物易于纯化等优点[4-5]，已广泛应用于多种天然产物的提取[6]。黄酮类化合物的提取、改性及功能研究是近年来天然产物研究方面的热点。但查阅大量文献发现，目前对田艾中黄酮类化合物的研究还鲜有报道。为了更好地开发利用田艾这种药食兼用的资源，本论文采用微波辅助有机溶剂法提取了田艾总黄酮，并对提取液进行了稳定性研究。研究结果旨在为田艾黄酮在医药、食品、化妆品工业中的应用提供理论依据，促进田艾资源的有效开发利用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

田艾绒：购自茂名市官渡市场；芸香叶·三水：国药集团化学试剂有限公司；其余常规化学试剂均为分析纯，均购于天津大茂化学试剂厂。

1.2 仪器

ZF-6型三用紫外分析仪：上海骥辉科学分析仪器有限公司；电热恒温鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；DG120型半斤装中药材粉碎机：浙江省瑞安市春海药材器械厂；722G可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；G70D20CNIP-D2（SO）型格兰仕微波炉：广东格兰仕微波炉电器制造有限公司；数显恒温水浴锅KW-1000DC：江苏金坛市亿通电子有限公司；SHB-3循环水多用真空泵：上海正保仪表厂。

1.3 方法

1.3.1 提取工艺流程及操作要点

田艾绒→粉碎→称取→预浸→微波处理→抽滤→滤液→60%乙醇定容→提取液

将田艾绒粉碎备用，称取1.000 g田艾绒，放入锥形瓶中，加入40 mL 60%乙醇溶液在常温下密封浸泡30 min，再在350 W的微波下作用60 s，提取1次，趁热抽滤，弃去滤渣。将滤液转入100 mL容量瓶中，用60%乙醇溶液定容至刻度线处备用。

1.3.2 田艾提取液中总黄酮的显色试验

1）盐酸—镁粉还原反应：取上述滤液5 mL于试管中，加少许镁粉，振摇，再加几滴浓盐酸，1 min～2 min后观察并记录实验现象。

2）铝盐络合反应：在滤纸上滴加1滴滤液，干燥后喷2%三氯化铝甲醇溶液，烘干，在紫外灯下观察，记录实验现象。

3）铅盐络合反应：取上述滤液5 mL于试管中，加几滴1%乙酸铅溶液，观察并记录实验现象。

4）氢氧化钠反应：取上述滤液5 mL于试管中，加1%氢氧化钠溶液，观察并记录实验现象。

5）浓硫酸反应：取上述滤液5 mL于试管中，加几滴浓硫酸，观察并记录实验现象。

1.3.3 黄酮标准曲线的建立

1.3.3.1 最大吸收波长的确定

称取干燥至恒重的芦丁标准品10 mg，用体积分数60%乙醇溶液溶解，定容于100 mL容量瓶中，摇匀，得0.100 0 mg/mL的芦丁标准溶液，置于冰箱贮存，备用。

准确吸取0.0、3.0 mL芦丁标准溶液于25 mL比色管中，用体积分数60%乙醇溶液稀释至10.0 mL，再加入1.0 mL的5%的亚硝酸钠溶液，摇匀，静置6 min，加入1.0 mL的10%硝酸铝溶液，摇匀，静置6 min，加入4.0 mL的10%氢氧化钠溶液，用60%乙醇溶液定容至刻度。放置15 min后，以不加芦丁标准液为参比，用可见分光光度计在480 nm～520 nm波长范围内测定吸收峰，选择吸光度最大时的波长即为芦丁标准溶液的最大特征吸收波长。以同样的方法，确定田艾提取液的最大特征吸收波长。

1.3.3.2 标准曲线的制作

分别取 0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 的芦丁标准溶液置于25 mL的比色管中，用体积分数60%的乙醇溶液稀释至10.0 mL，再加入1.0 mL的5%的亚硝酸钠溶液，摇匀，静置6 min，加入1.0 mL的10%硝酸铝溶液，摇匀，静置6 min，加入4.0 mL的10%氢氧化钠溶液，用60%乙醇溶液定容至刻度。放置15 min后，以不加芦丁标准液为参比，用1 cm的玻璃比色皿于芦丁标准液的最大吸收波长下测定吸光度。以吸光度A为纵坐标，芦丁标准溶液的浓度c（mg/mL）为横坐标绘制标准曲线，用最小二乘法进行回归，得到芦丁浓度c与吸光度A关系曲线的回归方程式。

1.3.4 田艾提取液总黄酮测定

将提取、定容备用的田艾提取液精确移取1.00 mL于25 mL比色管中，采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH体系络合显色步骤（同标准曲线制作），分别加入各种试剂后定容至刻度。在芦丁标准溶液的最大特征吸收波长处进行比色测定，以试剂作为空白。测得其吸光度后，由吸光度根据回归方程计算出浓度c，然后利用以下方程计算田艾总黄酮得率：

式中：y为总黄酮的得率，mg/g；c为经吸光度计算出的总黄酮浓度，mg/mL；V为测定时，移取到25 mL比色管中的体积，mL；n为样品提取液测定时的稀释倍数；m为田艾的质量，g；100为提取液定容的体积。

1.3.5 田艾总黄酮提取工艺的优化

用微波辅助乙醇法提取田艾总黄酮，对乙醇体积分数、料液比、微波功率、微波时间、预浸时间等因素进行单因素试验，找出对总黄酮提取影响显著的因素，再采用响应面分析试验优化提取工艺条件。

1.3.5.1 单因素试验

1）第一组预浸时间为 30 min，料液比为 1∶50（g/mL），微波功率为350 W，微波时间为60 s，改变乙醇体积分数（0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%）进行提取，测定总黄酮浓度，初步确定乙醇体积分数范围。

2）第二组预浸时间为30 min，乙醇体积分数为60%，微波功率为350 W，微波时间为60 s，改变料液比 1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60、1 ∶70（g/mL）进行提取，测定总黄酮浓度，初步确定料液比范围。

3）第三组预浸时间为30 min，乙醇体积分数为60%，料液比为 1 ∶50（g/mL），微波时间为 60 s，改变微波功率 210、280、350、420、490、560 W 进行提取，测定总黄酮浓度，初步确定微波功率范围。

4）第四组预浸时间为30 min，乙醇体积分数为60%，料液比为1∶40（g/mL），微波功率为350 W的条件下，改变微波时间 20、40、60、80、100、120 s进行提取，测定总黄酮浓度，初步确定微波时间范围。

5）第五组乙醇体积分数为60%，料液比为1∶40（g/mL），微波功率为 350 W，微波时间为 60 s，改变预浸时间 10、20、30、40、50、60 min 进行提取，测定总黄酮浓度，初步确定浸提时间范围。

1.3.5.2 响应面法优化试验

根据Box-Behnken中心组合试验设计原理[7]，结合单因素试验结果，以乙醇体积分数、微波功率和微波时间为影响因素，以总黄酮得率为响应值，采用三因素三水平的响应面分析法进行试验设计[8]，建立数学回归模型，对影响田艾总黄酮提取的工艺条件参数进行优化。因素水平见表1。

表1 Box-Behnken的中心组合因素水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken central component experiments design

2 结果与分析

2.1 田艾提取液的显色反应

按照1.3.2的提取方法得到的提取液进行显色反应的结果如表2所示。

表2 田艾提取液进行显色反应的结果Table 2 Results of Tian Ai extract color reaction

以上5个显色现象皆与相关文献记载相符，故可判断田艾中含有黄酮类化合物，并可能含有较多的异黄酮，可进行下一步试验。

2.2 标准曲线的绘制

在480 nm～520 nm波长范围内测定芦丁标准溶液及提取液的吸光度，芦丁标准溶液和田艾提取液可见光扫描图，如图1所示。

图1 芦丁标准溶液和田艾提取液可见光扫描图Fig.1 Rutin standard solution and Tian Ai extract visible light scan

图1结果表明，在506 nm处芦丁标准溶液及提取液吸光度最大，故选择506 nm为最大特征吸收波长。在此波长下，根据NaNO2-Al（NO3）3-NaOH体系络合显色测得芦丁浓度与吸光度的关系，绘制标准曲线如图2所示；以芦丁浓度c（mg/mL）对吸光度A做回归，得方程为：A=12.564c-0.004 1，R2=0.999 2，结果表明芦丁浓度在0～0.020 0 mg/mL范围内线性关系良好。

在506 nm处芦丁标准曲线，结果如图2所示。

图2 芦丁标准曲线Fig.2 Standard curve of rutin

2.3 单因素试验

2.3.1 乙醇体积分数对田艾总黄酮提取效果的影响

乙醇体积分数对田艾总黄酮提取效果的影响，结果见图3。

图3 乙醇体积分数对总黄酮得率的影响Fig.3 Effects of ethanol concentration on the yield of total flavonoids

由图3可知，在乙醇体积分数小于20%时，随着乙醇体积分数的增加，溶于乙醇中的黄酮增加，总黄酮得率也在提高；当乙醇体积分数达到20%时，田艾中总黄酮得率最高；在20%～50%范围内，随着乙醇体积分数的增加，总黄酮得率缓慢下降；在乙醇体积分数大于50%时，随着乙醇浓度的升高，总黄酮得率出现急剧下降趋势，这可能是由于田艾中其他有机物质与黄酮产生竞争作用，其溶出能力优于黄酮。在提取过程中，乙醇体积分数大于50%时，随着乙醇体积分数的增加，提取液由原来的棕黄色逐渐变绿，这可能是田艾中的有机色素大量溶出。譬如叶绿素等脂溶性物质的溶出较多，并导致溶液沸点下降，乙醇挥发严重导致体系温度下降从而影响黄酮的提取[9]；也有人用水提法进行总黄酮的提取[10]。综合考虑乙醇体积分数对总黄酮得率的影响，选10%、20%、30%为进一步优化的范围。

2.3.2 料液比对田艾总黄酮提取效果的影响

料液比对田艾总黄酮提取效果的影响，结果如图4所示。

图4 料液比对总黄酮得率的影响Fig.4 Effects of different ratio of solutions to material on the yield of total flavonoids

由图4可知，在料液比小于1∶50（g/mL）时随着乙醇溶液体积的增加，乙醇溶液对黄酮的溶解能力也在增加，总黄酮的得率也在提高；当料液比达1∶50（g/mL）时，总黄酮得率最大；由于田艾中所含黄酮的量是有限的，当田艾中的黄酮被较完全提出后，再增加乙醇体积，黄酮的提取量也不会有明显的变化了，总黄酮的得率基本趋于稳定。在实际操作中既要考虑总黄酮的充分溶出，同时也为避免溶剂的浪费，综合两方面的因素，料液比设置为1∶50（g/mL）时较佳。

2.3.3 微波功率对田艾总黄酮提取效果的影响

微波功率对田艾总黄酮提取效果的影响，结果见图5。

图5 微波功率对总黄酮得率的影响Fig.5 Effects of microwave power on the yield of total Flavonoids

由图5可以看出，当微波功率小于350 W时，随着微波功率的增大，总黄酮得率升高；当微波功率大于350 W后，随着微波功率的增大，总黄酮得率反而降低。这是因为微波提供的能量是通过极性分子的偶极旋转和离子传导两种作用直接透过透明的溶剂，传导到植物物料的细胞内部，使细胞内瞬间升温，随着微波能量的增大，加剧其内部压力超过细胞壁膨胀的能力，致细胞破裂，使细胞内的物质自由流出传递至周围的溶剂中被加速溶解[11-12]；当微波功率超过350 W后由于温度过高而使部分乙醇溶剂蒸发为气体减少了与田艾接触的几率，所以提取率会有所下降。且功率增大到一定程度，会破坏黄酮类物质，黄酮得率也会降低。故选取微波功率为280、350、420 W作为响应面优化试验的考察水平[13]。

2.3.4 微波作用时间对田艾总黄酮提取效果的影响

图6为微波作用时间对田艾总黄酮得率的影响结果图。

图6 微波作用时间对总黄酮得率的影响Fig.6 Effects of microwave duration on the yield of total Flavonoids

由图6可以看出，随着微波作用时间的增加，总黄酮的得率先升高后降低，在微波作用时间为60 s时最高。这是由于，微波辐射时间过短，黄酮类物质还未充分溶出；随着微波作用时间的延长，黄酮溶出量逐渐增大；60 s以后，随着提取时间的增加，体系的温度会过热并出现爆沸的现象，一方面高温可能导致黄酮类物质分解；另一方面，爆沸也会引起部分田艾被冲至容器壁上，影响液固两相的进一步接触，也有少部分溶液因爆沸而损失，最终使得率降低。因此，本研究选取微波作用时间为40、60、80 s作为响应面优化试验的考察水平[14]。

2.3.5 预浸时间对田艾总黄酮提取效果的影响

预浸时间对田艾总黄酮提取效果的影响，结果如图7所示。

图7 预浸时间对总黄酮得率的影响Fig.7 Effects of presoaking time on the yield of total flavonoids

由图7可以看出，在30 min内，随着预浸时间的延长，总黄酮得率逐渐升高；预浸超过30 min后，总黄酮得率趋于平缓。这可能是由于，预浸时间太短，有部分黄酮来不及溶出，延长预浸时间可使其继续溶出；而预浸时间太长，在室温下总黄酮的溶出达到饱和，故趋于平缓。因此，从总体来看预浸时间对田艾总黄酮得率的影响不大。综合考虑，选择田艾总黄酮的最佳预浸时间为30 min。

2.4 响应面法优化试验

2.4.1 响应面法试验结果及分析

响应面法试验结果及分析见表3、表4。

表3 试验设计与结果Table 3 Results of response surface analysis

表4 方差分析Table 4 Variance analysis

由表4可知，二次项乙醇体积分数和微波时间对总黄酮得率的曲面效应显著；比较各因子间交互作用，微波功率和微波时间之间的交互作用显著，各因素交互作用的响应面立体分析图见图8～图10。

在本试验设计范围内，回归方程模型显著性检测P＜0.05，显著，模型的相关系数0.033 8，失拟项不显著，说明该模型能解释响应值的变化，即该模型与实际试验拟合较好。比较一次项的P值，可知各因素对总黄酮得率的影响从大到小依次为微波时间、微波功率、乙醇体积分数。

图8 乙醇体积分数和微波功率对总黄酮得率的交互影响Fig.8 Response surface plot for effects of ethanol concentration and microwave power on the yield of total flavonoids

图9 乙醇体积分数和微波时间对总黄酮得率的交互影响Fig.9 Response surface plot for effects of ethanol concentration and microwave duration on the yield of total flavonoids

图10 微波功率和微波时间对总黄酮得率的交互影响Fig.10 Response surface plot for effects of microwave power and microwave duration on the yield of total flavonoids

根据回归方程得出不同因子的响应面和等高线结果见图8～图10所示。3D响应面图和二维等高线图可以将回归模型生动的表现出来。从图中可以较明显的分析出多个自变量对响应值的影响，而且还可以分析出响应面对不同自变量变化之间的敏感程度。响应面图反映出了，保持其中一个自变量不变的前提下，另外两个自变量对响应面值的影响。等高线图和响应面图相对应，响应曲面坡度越陡峭，等高线图形接近椭圆形，表明响应值对于操作条件的改变越敏感；反之曲面坡度越平缓，等高线图形接近圆形，表明操作条件的改变对响应值的影响也就越小[1]。图8～图10直观地反映了各因素交互作用对响应值的影响。

图8显示了乙醇体积分数和微波功率的交互作用对总黄酮得率的影响。从图8可以看出，等高线接近圆形，表明它们的交互作用不明显。从等高线可以看出，但乙醇体积分数不变时，微波功率过高不利于总黄酮的提取，总黄酮得率也随着微波功率的增加先增大后减少，但减少的幅度较小。

图9显示了乙醇体积分数和微波时间的交互作用对总黄酮得率的影响。从图9可以看出，乙醇体积分数、微波时间对总黄酮得率的影响都比较明显，因为曲面比较陡峭，而等高线接近圆形，表明它们的交互作用也是不明显的。当微波时间较短时，总黄酮得率随乙醇体积分数的提高先增大后趋于平缓；当微波时间较长时，总黄酮得率随乙醇体积分数的提高先缓慢增大后减少。当乙醇体积分数较低时，总黄酮得率随着微波时间的增加而增加；当乙醇体积分数较高时，总黄酮得率随着微波时间的增加先增加后减少。

图10显示了微波功率和微波时间的交互作用对总黄酮得率的影响。从图10可以看出，等高线为椭圆形，表明微波功率和微波时间的交互作用对总黄酮得率的影响明显。当微波时间较短时，总黄酮得率随微波功率的增加而增大；当微波时间较长时，总黄酮得率随着微波功率的增加而减小。当微波功率较低时，总黄酮得率随着微波时间的增加而增加；当微波功率较高时，总黄酮得率随着微波时间的增加先增加后快速减少。

2.4.2 最佳提取条件的确定

通过响应面分析优化，Design expert软件对回归方程进行计算，得到微波辅助提取田艾总黄酮的最佳工艺条件为：乙醇体积分数为20.80%，微波功率为353.79 W，微波时间为67.30 s；在此条件下模型预测总黄酮提取率为23.67 mg/g。考虑到实际操作条件的局限性，对最佳工艺条件进行如下修正：乙醇浓度20%，微波功率为350 W，微波时间为67 s。

2.5 验证试验

通过响应面优化得出最佳提取工艺条件为乙醇浓度20%，微波功率为350 W，微波时间为67s；根据此条件进行了3次平行验证试验，结果田艾中总黄酮的平均提取率为23.60 mg/g。说明试验结果与模型拟合良好，利用响应面分析法优化得到的超声提取工艺参数较确可靠，具有一定的可行性。

3 结论

以干燥的田艾为原料，以乙醇为提取溶剂，采用微波辅助提取，在单因素试验基础上，利用响应面法优化了提取工艺条件，结果为：料液比1∶50（g/mL），预浸时间为30 min，乙醇体积分数20%，微波功率为350 W，微波时间为67 s，田艾中总黄酮的实际得率为23.60 mg/g。结果表明，田艾中含有丰富的黄酮类化合物，具有很好的食用价值和开发利用前景，为田艾的进一步开发利用提供了可靠依据。

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Optimization of Extraction Technology of Total Flavonoids from Tian Ai by Response Surface Methodology

ZHANG Ling1，2，LIANG Yan2，YE Ri-qing2，ZHANG Zhong1，2
（1.Technology Development Center for Fruit&Vegetable Processing and Storage Engineering of Guangdong Colleges and Universities，Guangdong University of Petrochemical Technology，Maoming 525000，Guangdong，China；2.College of Environmental and Biological Engineering，Guangdong University of Petrochemical Technology，Maoming 525000，Guangdong，China）

With Tian moxa as raw material，using microwave auxiliary ethanol method to extract the total flavonoids in Tian Ai.On the basis of single factor experiment，the ethanol concentration，microwave power and time was chose as the independent variable and the total flavonoids yield was used as response value，and the extraction process of total flavonoids in Tian Ai was optimized by response surface methodology of Box-Behnken mode.The results showed that the optimum extraction technology conditions were solid-liquid ratio for 1 ∶50（g/mL），presoak time for 30 min，ethanol concentration for 20%，microwave power was 350 W，microwave time of 67 s.Under the condition，the actual extraction yield of Tian Ai total flavonoids was 23.60 mg/g.

Tian Ai；total flavonoids；extract；response surface methodology

2016-07-27

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.14.008

广东高校果蔬加工与贮藏工程技术开发中心开放基金（2015A004）

张玲（1979—），女（汉），副教授，硕士研究生，主要从事农产品加工与贮藏。