牙本质非胶原蛋白对人根尖牙乳头干细胞增殖及分化能力的影响

2017-07-18孟琳，金磊，刘妍

陕西医学杂志 2017年7期

关键词：牙本质胶原蛋白生长因子

孟琳，金磊，刘妍

大连大学附属中山医院口腔科 (大连 116001)

牙本质非胶原蛋白对人根尖牙乳头干细胞增殖及分化能力的影响

孟琳，金磊，刘妍

大连大学附属中山医院口腔科 (大连 116001)

目的：探讨牙本质非胶原蛋白(DNCP)对人根尖牙乳头干细胞(SCAP)的细胞增殖能力和分化能力的研究。方法：按照诱导液的不同，将81例实验样本分为两组，DNCP组41例和血小板裂解液(PL)组40例，分离两组样本的人根尖牙乳头，脂肪干细胞分离及培养采取酶消化法，以免疫组化技术对细胞进行鉴定，待样本经诱导后，观察两组样本在相差显微镜下的细胞形态改变，细胞增殖的测定采取MTT法，比较两组SCAP的细胞增殖与分化的差异。结果：①DNCP组和PL组免疫指标CD44阳性率(依次为92.68%、92.50%)、CD105阳性率(95.12%、95.00%)及总阳性率(93.90%、93.75%)比较，均无统计学差异(P均>0.05)；②DNCP组在细胞核清晰数目(85.37%)、核仁数量在2个以上的比率(68.29%)及极性改变发生情况(82.93%)均显著高于PL组(P均<0.05)；③DNCP组诱导后的OD值(0.379±0.204)明显高于PL组(0.345±0.198) (P<0.05)。结论：DNCP对SCAP具有一定矿化能力，在SCAP中对增殖和分化可能存在一定促进作用。

近几年，部分医学专家在发育不完全的牙根尖内提取人根尖牙乳头干细胞(Stem cellsfrom the apical papilla，SCAP)。Sonoyama等[1]以猪为动物模型进行实验，通过磷酸三钙、羟磷灰石的辅助作用，将SCAP植入猪下颌牙槽窝内，并于3个月后进行检查，发现猪牙槽窝内生成了类似牙根的组织结构。虽然关于SCAP的研究众多，但关于成牙本质细胞增殖与分化诱导液的研究却较为有限。牙本质非胶原蛋白(Dentin non-collagenous protein，DNCP)主要成分为生长因子、牙本质特异性蛋白、蛋白多糖等，对上皮结构的增长具有一定促进意义[2-3]。而血小板裂解液(Platelet lysate，PL)为典型的血小板富集物之一，其不仅能够降低免疫原性，自身还具有多种生长因子，可以为异体或异种移植提供有利条件[4]。基于此，本研究对DNCP与PL诱导SCAP的效果展开分析，现报告如下。

材料与方法

1 样本选择选取81例人根尖牙乳头组织样本，纳入及排除标准[5-6]：①均无系统性疾病；②无传染性疾病者；③样本资料完整，均符合实验要求；④排除当月使用过抗生素者。本研究经我院医学伦理委员会通过。将上述样本按照实验所用诱导液的区别，分为DNCP组41例和PL组40例，经比较，两组基线信息比较无明显统计学差异(P>0.05)，能够匹配研究。

2 主要试剂和仪器 α-MEM培养基、胎牛血清、Collagenase酶Ⅰ型、Dispase酶(由美国Gibeo公司提供)、浓度为1%的PBS缓冲液(由德国hyclone公司提供)、透析袋(由美国光谱医学公司提供)、鼠抗人STRO-1单克隆抗体、FITC标记的抗鼠抗体、S-ABC免疫组化试剂盒(均由美国SANTA CRUZ公司提供)、MTT细胞增殖试剂盒(由美国Trevigen公司提供)、0.4%台盼蓝染色剂(由上海哈灵生物科技公司提供)。TS100倒置相差显微镜(由日本NIKON公司提供)、全波长酶标仪(由美国热电公司提供)、FACS Calibur流式细胞仪(由美国BD公司提供)、DMLB2HC图像捕获与测试系统(由美国LEICA公司提供)。

3 实验方法

3.1 脂肪干细胞的分离与培养：将两组样本均以PBS液洗涤3次，兑入适量的Collagenase酶Ⅰ型(浓度为0.1%)，在5%CO2培养箱中消化30min，温度控制在37℃左右。消化完毕，再以PBS液反复冲洗，以200目筛网过滤，制备成单细胞悬液。以1200r/min离心，5min后进行上清分离，连续清除2次。按照5×105/ml的密度将分离好的标本放置于无菌培养瓶中，之后放入培养箱中培养，待24h后进行PBS液冲洗，同时去除未贴壁的细胞，在细胞贴壁率达到80%时，以Dispase酶进行传代。

3.2 脂肪干细胞鉴定：在Dispase酶成功传代后，将其制备成细胞悬液。按照单孔5×104个细胞的密度接种于6孔板盖玻片上，并放置于5%CO2培养箱内消化，温度应调控在37℃，直到细胞贴壁后，再以PBS液清洗3次，放置30min后，按照浓度为CD441∶50、CD1051∶500的一抗实施免疫组化染色。

3.3 DNCP与PL的制备：①DNCP的制备：将人根尖牙乳头组织样本去髓，磨去釉质与牙骨质，捣成粉末，取500μg，溶解于EDTA溶液中，在4℃环境中浸泡2d，直至全部溶解，再将其倒入45 ml α-MEM培养基中(含胎牛血清20ml/L)，之后将上清液保存在透析袋中，之后倒入烧杯中，加双蒸水透析，并分装于离心管内，真空干燥，收集DNCP备用。②PL的制备：采集新鲜ACD-A抗凝血小板，将其混匀，并通过生理盐水制备成悬液，清除血浆，要求血小板达到1×109/ml 以上的浓度，再将样本反复冻融3次，温度设置为-80℃和37℃，时间间隔掌控在12h左右。取900g冻融裂解产物进行分离上清处理，将分离后的血小板裂解液以0.22μm滤器过滤，分装后放在-80℃的环境保存，使用前再以37℃水浴融解。

3.4 诱导液作用脂肪干细胞后的增殖情况：将生长对数期的干细胞样本制备成悬液，按照4.5×106/ml 接种于96孔板，置入培养箱，取出以PBS液冲洗，待细胞贴壁后，将其分为两组：DNCP组与PL组。两组均加入等量培养液，各100μl，并各自培养3d。在培养结束前4h各孔分别加入0.5%MTT液20μl，培养完毕后，用无菌针头吸去液体，再各自加入150μl DMSO结晶，以S-ABC免疫组化试剂盒检测各孔OD值，重复操作3次，以平均值计算。

4 观察指标比较两组免疫染色CD44、CD105阳性率，观察细胞形态，于使用诱导液前及使用诱导液培养3d后比较两组细胞增殖情况的改变。

结果

1 两组免疫组化染色结果的比较两组免疫指标CD44、CD105阳性率及总阳性率比较，均无统计学差异(P均>0.05)，见表1。

表1 组间免疫组化染色结果的比较[例(%)]

2 两组细胞形态的比较 DNCP组与PL组在细胞核是否清晰、核仁数量及有无极性改变方面比较，均有统计学差异(P均<0.05)，见表2。

3 两组细胞增殖情况的比较 DNCP组和PL组在诱导后的OD值均明显上升(P均<0.05)，DNCP组上升更为显著(P<0.05)，见表3。

表2 组间细胞形态的比较[例(%)]

表3 组间细胞增殖情况的比较

讨论

牙根发育与再生具有复杂的调控机制，是一个多因素参与的过程。在牙齿发育中，牙囊细胞发挥着重要作用，其需经牙断裂的上皮根鞘，与SCAP和前期牙本质长时间密切接触，产生相互作用，只有在这种条件下，牙根组织才能实现再生的可能[7-8]。血小板富集物在干细胞增殖、修复和再生方面的作用已被多个文献报道[9-10]，而PL为血小板富集物的一种，是其裂解后的产物，相比血小板富集物而言，其具有更好的免疫原性，富含转化生长因子、血小板衍生因子、上表皮生长因素及正常T淋巴细胞表达等多种液态生长因子，这些因子对骨改建的再生与修复作用已被证实。DNCP是从发育期牙本质中取得的间充质干细胞，经科学研究发现，DNCP富含骨成型蛋白质、胰岛素样生长因子、6-甲基尿嘧啶与转化生长因子等多种具有向成牙本质细胞分化作用的因子，对激发牙髓活力，使患牙重新生成牙髓具有较好的促进作用。虽然二者对于牙周组织的改建作用均被证实[11]，但二者在SCAP细胞增殖与分化能力方面的研究仍欠缺完善。基于此，本实验选取基础信息较为匹配的两组进行诱导液实验。研究表明，DNCP组和PL组在免疫指标CD44阳性表达率、CD105阳性表达率方面比较无统计学差异(P均<0.05)，但二者在细胞分化方面，DNCP诱导液在细胞核清晰程度、核仁数量、极性变化等方面均具有显著优势(P均<0.05)，同时，细胞增殖实验表明，DNCP OD值(0.379±0.204)显著高于PL组(0.345±0.198) (P均<0.05)，可见DNCP的增殖与分化能力较PL更具优势，可能与其独有的成分有关，其中骨成型蛋白质具有促进祖细胞和成骨细胞分化，诱导非骨组织来源分化，刺激胶原的合成，增强碱性磷酸酶的活性有关。胰岛素样生长因子是一种结构和功能都与胰岛素类似的多肽类神经营养因子[12]，主要由肝细胞分泌，部分来自组织的自分泌或旁分泌[13]。胰岛素样生长因子在软骨细胞增殖方面与软骨基质合成方面具有良好作用，可以刺激II型胶原蛋白合成，对磷酸酯酶和糖胺聚酶的活性增强具有显著作用，在促进细胞分化成熟具有显著功效。除此，转化生长因子、6-甲基尿嘧啶均参与牙周组织的改建，这使DNCP在SCAP增殖与分化中发挥良好作用。

综上所述，DNCP在SCAP中对增殖和分化发挥了较好的诱导作用，对SCAP的细胞改建有积极意义，伴随生物医学高速发展，牙根发育与再生技术还可得到进一步完善。

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