利用实时荧光PCR快速筛查玉米中转基因成分

张海波, 刘 冰, 杨娟妮, 张 田, 张 英

(1.陕西省种子管理站，西安 710018；2.农业部农作物种子质量监督检验测试中心，西安 710018)

利用实时荧光PCR快速筛查玉米中转基因成分

张海波1,2, 刘 冰1,2, 杨娟妮1,2, 张 田1,2, 张 英1,2

(1.陕西省种子管理站，西安 710018；2.农业部农作物种子质量监督检验测试中心，西安 710018)

玉米是拥有转基因转化体数量最多的作物，多样的转化体增加了玉米中转基因成分筛查的难度。为了建立玉米中转基因成分的快速筛查方法，利用Taqman探针实时荧光PCR方法，通过对玉米样品中CaMV35S启动子(P-35S)和NOS终止子(T-NOS)2个元件组合的检测，完成对现有玉米转化体的筛查。建立的Taqman探针实时荧光PCR方法灵敏度可达到0.1%，检测时间较普通PCR方法缩短1 h以上。同时提出了转基因玉米转化体鉴定路线图。该筛查方法可对玉米中的转基因成分进行快速、高灵敏度的筛查。

转基因玉米；Taqman探针实时荧光PCR；快速筛查；CaMV35S启动子

随着转基因植物及其产品越来越受到消费者关注，快速、准确的转基因成分筛查方法，将成为维护消费者权益的重要技术支撑。以PCR 技术为基础的方法是转基因成分检测中最为快速和准确的方法[1]。常规PCR检测由核酸提取、PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳3个步骤组成。Taqman探针实时荧光PCR技术近年来越来越多的应用于转基因成分检测中，它是在常规PCR基础上，添加一条标记2个荧光基团的探针(Taqman探针)，能在PCR扩增过程中，通过记录荧光信号强度的变化，对扩增产物的积累进行实时监控，从而能在扩增结束时对结果进行判断[2]。以Taqman探针实时荧光PCR 技术为基础的转基因成分检测可将检测步骤缩短为两步，即核酸提取和PCR扩增，可提高检测效率，节约时间成本[3]。另外，琼脂糖凝胶电泳中使用的染色剂溴化乙锭(EB)为强烈致癌物质，若操作不当，会危害试验人员的健康。而Taqman探针实时荧光PCR检测则采用完全闭管检测，无需PCR后处理，避免交叉污染和假阳性的风险。

玉米是具有转基因转化体数量最多的作物，包括29个转化体和26个叠加品系，其中叠加品系是由2个或2个以上的转化体杂交而成，如TC1507×NK603，Bt11×MIR604×GA21[4-5]。叠加品系的检测可通过对形成叠加品系的转化体的检测来完成，本试验主要以29个玉米转化体为研究对象，根据张海波等[6]2015年的研究结果，进行P-35S和T-NOS的检测，可以覆盖27个玉米转化体。新增的抗虫耐除草剂转基因玉米转化体4114含有P-35S，耐除草剂转基因玉米转化体5307含有T-NOS[4]。因此，根据玉米转基因成分筛查原则，同时进行P-35S和T-NOS检测，可以覆盖所有的29个玉米转化体。

根据农业部报告，中国将遵循非食用、间接食用、食用的步骤推进转基因作物的商业化，即首先发展非食用的经济作物，其次是饲料作物、加工原料作物，再次是一般食用作物，最后才是主粮作物[7]。中国批准种植的转基因作物只有棉花和木瓜，没有批准任何转基因主粮的商业化生产[8]。而获准作为加工原料进口到中国的转基因玉米转化事件也只有15个(截至2016年1月有效)，分别为3个耐除草剂玉米GA21、NK603、T25，9个抗虫玉米MON89034、MON810、MIR604、Bt11、TC1507、59122、Bt176、MIR162，2个抗虫耐除草剂玉米MON88017 、Bt11×GA21，1个耐旱玉米MON87460和1个品种改良玉米Event 3272[4,9]。因此，转基因作物监控的重点，在于未批准作物的非法种植和使用，即在大量的非转基因作物和产品中筛查出非法种植和使用的转基因作物和产品。这就需要快速准确的转基因成分筛查方法。筛查出含有转基因成分的样品要进行具体转化体的鉴定。

本研究利用Taqman探针实时荧光PCR技术，通过对P-35S和T-NOS检测，建立转基因玉米的快速筛查方法，测定检测方法的灵敏度，同时提出转基因玉米转化体鉴定路线图。该方法可实现对玉米中转基因成分的快速准确筛查和鉴定。

1 材料与方法

1.1 材 料

非转基因玉米种子‘郑单958’由农业部农作物种子质量监督检验测试中心(西安)收藏，转基因玉米标准物质粉末MON863、Bt176、Bt11、NK603、MON810、GA21、MIR604、Event 3272、Event 98140、59122和TC1507由欧洲标准局(Institute for Reference Materials and Measurements, IRMM)制作，并购买于上海安谱实验科技股份有限公司。

Taqman探针实时荧光PCR扩增试剂[Premix ExTaqTM(Probe qPCR)，RR390A]购自宝生物工程(大连)有限公司。扩增引物和Taqman探针由宝生物工程(大连)有限公司合成。

1.2 序列比对

用Alignment序列比对软件(Vector.NTI.Advance.v10.3-RECOiL)比对不同转基因玉米转化体P-35S和T-NOS的DNA序列，并与Taqman探针实时荧光PCR的引物探针序列比对。

1.3 基因组DNA提取

样品基因组DNA的提取采用天根生化科技(北京)有限公司生产的新型植物基因组DNA提取试剂盒(DP320)。DNA的纯度和质量浓度使用紫外分光光度计ND2000[赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)]测定，260 nm与280 nm吸光度比值为1.8～2.0，DNA质量浓度为50～100 mg/L。DNA样品的完整性使用 8 g/L 琼脂糖凝胶电泳和EB染色检测。玉米内标准基因(zSSⅡb)扩增测定DNA样品中是否存在扩增抑制物质。

1.4 Taqman探针实时荧光PCR

Taqman探针实时荧光PCR扩增条件及扩增程序依据农业部1782号公告-3-2012[10]中相应标准执行，其中PCR扩增循环数增加至50个循环。Taqman探针实时荧光PCR扩增使用ABI StepOne Plus实时荧光PCR仪(美国Applied Biosystems)进行，并使用仪器自带软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 Taqman探针实时荧光PCR筛查引物和探针序列与转基因玉米转化体序列比对

在使用基因枪或根癌农杆菌将外源基因转入受体植物的过程中，经常会发生基因重排或片段丢失的现象，加之研发人员根据宿主植物密码子的偏好对基因片段进行修饰，使得名称相同的基因元件在不同的转化体中可能具有不同的核苷酸序列[11]。因此，在选择检验方法时，必须对需要检测的转化体目标序列和检测方法中的引物探针序列进行比对分析，以保证选择的方法能够检测出最多的目标转化体[12]。本研究从欧洲转基因生物指南转基因数据库[5]、转基因检测方法数据库[9]和文献报道中[13]收集到的序列进行对比，确定合适的筛选引物探针进行检测。经过序列比对，选择农业部1782号公告-3-2012中的P-35S和T-NOS的引物探针，具体序列信息见表1。图1和图2显示P-35S、T-NOS序列与引物探针序列的比对结果。

表1 筛查检测中所用的引物和探针Table 1 Primers and probes used in the screening method

2.2 P-35S、T-NOS序列比对分析

图1显示MON89034、MON88017、Event 98140、MON810、MON863、TC1507、NK603、59122、Bt11、T25 10个玉米转基因转化事件的P-35S序列比对结果和引物探针位置。图中浅灰色覆盖的序列表示在不同转化事件中该序列位点有差异，转基因玉米的P-35S序列有部分差异，其中3个差异位点落在引物探针的区域(图1)。在正向引物35S-F的序列比对中，TC1507的P-35S有一个差异位点为T，其他玉米转化事件和正向引物，对应的位置都为G。在反向引物35S-R的序列比对中，NK603的P-35S有一个缺失位点，而其他玉米转化事件和反向引物，对应的位置都为T。在探针35S-P的序列比对中，Bt11的P-35S有一个差异位点为A，而其他玉米转化事件和探针序列，对应的位置都为G。

图2显示MON89034、MON88017、Event 3272、MIR604、CBH351、Bt11 6个玉米转化事件的T-NOS序列比对结果和引物探针位置。转基因玉米T-NOS的序列是完全一致，并与引物和探针完全配对。

对转基因玉米P-35S序列中的差异进行分析发现，TC1507和NK603引物35S-F/R上的差异位点均处于引物的5′端。引物5′端序列的错配一般并不影响PCR扩增反应的正常进行，因此TC1507和NK603引物35S-F/R上的差异位点可以忽略。探针序列上的错配对PCR扩增反应的影响，与探针上使用的荧光基团组合有关，例如TaqMan-MGB探针对错配非常敏感，一般用于SNP分析。常用的以FAM为报告基团、TAMRA为淬灭基团的荧光组合，对少量错配并不敏感。因此，本研究中使用的探针在合成时，选择使用FAM/TAMRA标记，以减小Bt11探针上的错配对PCR扩增反应的影响。同时，在筛查检测中，TC1507、NK603和Bt11的检测结果将被列为关注的重点，以验证选择的实时荧光检测方法适合玉米转基因成分的快速筛查。

方框表示引物和探针序列、箭头表示引物方向；浅灰色覆盖的序列表示在不同转化事件中该序列位点有差异 Box means the sequences of primers/probe and arrow means the direction of primers；light grey background means different sequences among different GM maize events.

图1 P-35S序列比对和引物探针位置
Fig.1 Sequences alignment of P-35S and the primers/probe location

2.3 Taqman探针实时荧光PCR方法对转基因玉米转化体的筛查检测

为了验证选择的P-35S和T-NOS实时荧光筛选方法是否适合对玉米中的转基因成分进行筛查，利用表1中的引物对实验室已有的转基因玉米MON863、Bt176、Bt11、NK603、MON810、GA21、MIR604、Event 3272、Event 98140、59122、TC1507和非转基因玉米‘郑单958’进行试验验证。

Taqman探针实时荧光PCR检测结果如图3所示。图中蓝色曲线为P-35S筛查检测结果，红色曲线为T-NOS筛查检测结果。曲线有上扬的为检测结果阳性，曲线无上扬的为检测结果阴性。在P-35S和T-NOS的实时荧光筛选检测结果中，P-35S和T-NOS都为阳性的玉米转化事件有MON863、Bt11、NK603；P-35S阳性、T-NOS阴性的玉米转化事件有Bt176、MON810、Event 98140、59122、TC1507；P-35S阴性、T-NOS阳性的玉米转化事件有GA21、MIR604、Event 3272；P-35S和T-NOS都为阴性的是非转基因玉米‘郑单958’。与预期结果一致。

从图3可看出，对于有序列错配的转化事件Bt11、NK603和TC1507，其P-35S的检测结果并未受到错配的影响，与预期结果一致。

2.4 转基因玉米Taqman探针实时荧光PCR方法灵敏度检测

使用来源于IRMM的不同转基因含量的Bt11粉末，对所选用的实时荧光筛查方法进行灵敏度测试。转基因含量分别为5%、2%、1%、0.5%和0.1%的Bt11粉末(IRMM编号分别为ERM-BF412F、ERM-BF412E、 ERM-BF411D、ERM-BF412C、ERM-BF412B)分别进行P-35S和T-NOS的实时荧光PCR扩增，每个样品的每个检测参数重复3次，结果如图4所示。P-35S和T-NOS的检测中，5个梯度的Bt11粉末的3个重复都可以检测到，说明本研究所选用方法的灵敏度可达到0.1%。

方框表示引物和探针序列、箭头表示引物方向 Box means the sequences of primers/probe and arrow means the direction of primers

图2 T-NOS序列比对和引物探针位置
Fig.2 Sequences Alignment of T-NOS and the Primers/probe Location

2.5 转基因玉米转化体鉴定路线图

在对玉米样品进行转基因检测时，首先联合使用P-35S和T-NOS进行筛查，确认其是否含有转基因成分，如果检出转基因成分，则需要进行进一步的转化体确认。按照图5所示的筛查路线图，可以利用其他常用的筛查元件，逐步缩小范围，最终通过转化体特异性引物进行确认。

如图5所示，如果P-35S和T-NOS的检测结果都为阴性，则认为样品中未检出转基因成分。如果P-35S和T-NOS筛查结果都为阳性时，可继续使用 CP4-EPSPS基因筛查，若为阳性，则进行 PINⅡ基因筛查；若为阴性，则进行Bar基因筛查，逐步缩小范围，直至确定到转化体。如果P-35S检测结果为阳性，而T-NOS检测结果为阴性，可继续使用 PINⅡ筛查，再进行Bar基因筛查。如果P-35S检测结果为阴性，而T-NOS检测结果为阳性，可继续使用CP4-EPSPS基因筛查，若为阳性，则进行GA21转化体检测确认；若为阴性，则进行MIR604、Event 3272或MIR162转化体检测确认。

与直接利用转化体特异性引物逐一确认的方法相比，该路线图能极大的减少检测工作量，更加高效地完成转化体确认。

蓝色、红色线分别为P-35S、T-NOS扩增曲线 Blue and red line means the amplification plot of P-35S and T-NOS, respectively

图3 Taqman探针实时荧光PCR检测转基因玉米中的P-35S和T-NOS
Fig.3 Taqman Real-time PCR detection of P-35S and T-NOS in GM maize

图4 P-35S和T-NOS Taqman探针实时荧光PCR检测方法灵敏度扩增曲线Fig.4 Sensitivity amplification plot of P-35S and T-NOS Taqman Real-time PCR

3 讨 论

随着转基因作物在全球范围内种植面积的日益扩大，人们对转基因生物的食用安全、饲用安全和环境安全的关注及担忧日益增加。中国对农业转基因生物安全监管十分严格，《种子法》、《农业转基因生物安全管理条例》等法律法规，对农业转基因安全评价、产品标识、生产许可、加工许可、经营许可、进口审批都有十分严格、细致的规定。中国目前尚未批准转基因玉米的商业化种植，仅允许15个转基因玉米转化事件作为加工原料进口。因此，转基因玉米的安全监管主要集中严防进口转基因玉米的非法流通和转基因玉米的非法繁育。

农业主管部门对转基因玉米的安全监管是以快速、准确、灵敏的检测技术为支撑，加大执法力度和速度，及时防止非法转基因玉米扩散对中国农业生产及食品加工行业造成危害。因此，加强玉米中转基因成分检测，不仅是保障我国农业和食品安全、维护法律尊严的要求，对于确保我国农作转基因生物安全和有序推广具有十分重要的意义。

本研究利用Taqman探针实时荧光PCR方法，通过联合对P-35S和T-NOS的检测，完成玉米中转基因成分的筛查。该方法快速、准确，灵敏度可以达到0.1%，这与Wu等[13]、吴明生等[14]的检测灵敏度近似，为玉米中转基因成分的快速筛查提供依据。

随着转基因育种技术在农作物中应用的不断深入，同时，作物种类和基因种类的不断增加，转基因检测技术也需要根据监管对象的发展不断升级与改进，更好地适应转基因技术发展，并为转基因作物的监管提供有力的技术支撑。

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(责任编辑：成 敏 Responsible editor:CHENG Min)

Rapid Screening of Genetically Modified Maize Based on Taqman Real-time Fluorescence PCR Method

ZHANG Haibo1,2, LIU Bing1,2,YANG Juanni1,2, ZHANG Tian1,2and ZHANG Ying1,2

(1.Shaanxi Seed Administration Bureau, Xi’an 710018, China; 2.The Crop Seed Quality Testing Center in Xi’an, Ministry of Agriculture, Xi’an 710018, China)

Maize is the crop of having the largest amount of genetically modified (GM) events. Varied GM events make it difficult to screen GM ingredients in maize. In order to establish a rapid screening method for GM maize, the combination of CaMV35S promoter (P-35S) and NOS terminator (T-NOS) was used to screen all the commercial GM maize events based on Taqman real-time fluorescence PCR. The sensitivity of the method was of 0.1%.The time cost in Taqman real-time fluorescence PCR was one hour less than conventional PCR.In addition, the identification pathway of genetically modified maize event was presented in this article. In conclusion, this Taqman real-time fluorescence PCR method can be used for rapid and sensitive screening of GM maize events.

Genetically modified maize; Taqman Real-time PCR Method; Rapid Screening; CaMV35S Promoter

2016-07-12 Returned 2016-10-04

ZHANG Haibo, male,master,agronomist.Research area:GMO detection methods research. E-mail: 46974104@qq.com

ZHANG Ying,male,senior agronomist.Research area: GMO detection methods research. E-mail: zhying6@gmail.com

日期：2017-06-05

2016-07-12

2016-10-04 第一作者：张海波，男，硕士，农艺师，从事农作物种子质量管理和分子检验工作。E-mail：46974104@qq.com 通信作者：张 英，男，高级农艺师，从事农作物种子质量管理和分子检验工作。E-mail：zhying6@gmail.com

S513;Q946.2

A

1004-1389(2017)06-0840-09

网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170605.1715.012.html