组蛋白去乙酰化酶6在弥漫性大B细胞淋巴瘤中的表达及意义

林晓骥，钱紫君，倪励斌，孙妮，周晓海，童欢欢，周舒萍，姚荣欣

（温州医科大学附属第二医院 血液科，浙江 温州 325027）

组蛋白去乙酰化酶6在弥漫性大B细胞淋巴瘤中的表达及意义

林晓骥，钱紫君，倪励斌，孙妮，周晓海，童欢欢，周舒萍，姚荣欣

（温州医科大学附属第二医院 血液科，浙江 温州 325027）

目的：观察组蛋白去乙酰化酶6（HDAC6）在弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）中的表达情况，并探讨其与各种临床病理因素及生存情况的关系。方法：选取2007年12月-2015年9月在温州医科大学附属第二医院确诊的93例DLBCL患者和15例反应性淋巴结增生患者作为研究对象。应用免疫组织化学染色检测DLBCL组织HDAC6蛋白表达情况，χ2检验和Kaplan-Meier法分析HDAC6的表达与各种临床因素和生存情况的关系。结果：在93例DLBCL组织中HDAC6高表达率为69.9%，显著高于反应性淋巴结增生组织的20%（P＜0.05）。在DLBCL中，高表达组国际预后指数（IPI）评分为0～2分的比例显著高于低表达组（P＜0.05），乳酸脱氢酶升高和β2-微球蛋白值升高比例均显著低于低表达组（P＜0.05）。Kaplan-Meier生存分析结果显示HDAC6高表达组的5年总生存时间和无进展生存时间均显著高于低表达组。结论：HDAC6在DLBCL患者中呈高表达，高表达组患者有IPI评分低和肿瘤负荷轻的特点。HDAC6高表达是DLBCL的良好预后因素。

弥漫性大B细胞淋巴瘤；组蛋白去乙酰化酶6；预后

弥漫性大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）是恶性淋巴瘤WHO分类中最常见的非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin’s lymphoma，NHL）类型，占成人NHL的30%～40%，为一组异质性很强的B细胞性淋巴瘤[1]。DLBCL临床病程呈侵袭性，随着免疫化疗的引入，本病的长期缓解率得到了进一步提高，但仍有部分DLBCL患者疗效不佳。因此，国内外学者热衷于对DLBCL发病机制和预后相关因

素进行研究[2-3]。组蛋白去乙酰化酶6（histone deacetylase 6，HDAC6）作为HDAC家族中的一员，被证实与多种不同的肿瘤发生发展关系密切。MARQUARD等[4]研究揭示，在皮肤T细胞淋巴瘤中发现有HDAC6的异常表达，而且HDAC6的表达程度与患者的预后呈正相关，HDAC6高表达的患者生存时间更长。但有关HDAC6在DLBCL中的作用研究甚少，因此我们探讨HDAC6在DLBCL中的表达及临床意义，为DLBCL的预后提供可靠的预测指标。

1 资料和方法

1.1 一般资料 选取2007年12月至2015年9月在温州医科大学附属第二医院确诊，资料完整的93例DLBCL患者为研究对象，另选15例淋巴结反应性增生患者作为对照。所有病例的组织病理学诊断严格按照WHO造血和淋巴组织肿瘤性疾病分类标准[5]。临床分期和近期疗效分别参照Ann Arbor标准[6]和1999年淋巴瘤疗效评价标准[7]进行评价。本研究经温州医科大学附属第二医院伦理委员会通过，患者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学染色：所有石蜡标本制成3～5 μm厚度的切片，进行免疫组织化学染色（SP法）。严格按照试剂盒说明书，将已确定的阳性组织切片作为阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照。用HDAC6鼠抗人单克隆抗体（美国Abcam公司）检测HDAC6的表达，胞质出现棕黄色颗粒判为阳性。

1.2.2 免疫组织化学染色程度评分及实验分组：不着色为0分，着色淡为1分，着色适中为2分，着色深为3分；阳性细胞百分比评分：≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，≥51%为3分。按两积分相乘计算总分，0～1分为阴性（-），2～3分为弱阳性（+），4～6分为中等阳性（++），＞6分为强阳性（+++）。参考相关文献[8]，将HDAC6表达（-/+）划为低表达组，（++～+++）划为高表达组。

1.2.3 治疗方法：所有DLBCL患者均接受R-CHOP或CHOP方案化疗。CHOP方案：环磷酰胺750 mg/m2，静脉注射，第1天；表阿霉素70～90 mg/m2，静脉注射，第1天；长春地辛2 mg/m2，静脉注射，第1天；泼尼松100 mg/m2，口服1～5 d。R-CHOP方案：在CHOP方案基础上，在化疗前1 d给予利妥昔单抗375 mg/m2，静脉滴注。3周为1疗程，中位化疗疗程为5（4～8）个。对化疗后残留病灶或化疗前巨大肿块给予区域放疗（范围8～50 Gy，中位45 Gy）。

1.2.4 随访：随访的截止时间为死亡或2015年12 月11日，中位随访时间47（4～98）个月。本组的研究终点是总生存时间（overall survival，OS）和无进展生存时间（progression-free survival，PFS）。OS定义为初次确诊至死亡或末次随访时间，PFS定义为治疗有效开始至淋巴瘤进展、复发、死亡或末次随访时间。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS13.0统计软件进行处理。计数资料采用χ2检验，生存分析采用Kaplan-Meier法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

图1 DLBCL组织中HDAC6的表达情况（×400）

2.1 DLBCL患者HDAC6表达情况 HDAC6呈棕黄色颗粒，主要定位于细胞的胞质。93例DLBCL患者中，低表达组28例（占30.1%），其中弱阳性12例，阴性16例；高表达组65例（占69.9%），其中中等阳性24例，强阳性41例，见图1。15例反应性淋巴结增生患者中，高表达组3例（占20%），低表达组13例（80%），与DLBCL患者比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 DLBCL患者HDAC6表达情况与临床特征关系HDAC6高表达组的国际预后指数（international prognostic index，IPI）为3～5的患者比例显著低于低表达组（P＜0.05）；高表达组的乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase，LDH）升高患者比例显著低于低表达组（P＜0.05），β2-微球蛋白升高患者比例亦低于低表达组（P＜0.05）；低表达组与高表达组的性别、年龄、Ann Arbor分期、ECOG评分、GCB/ 非GCB比例以及原发部位差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 HDAC6表达与DLBCL临床特征的关系[例（%）]

2.3 HDAC6对DLBCL患者生存的影响 93例患者5年OS和5年PFS分别为59.5%和46.1%；HDAC6低表达组的5年OS（为41.9%）显著低于高表达组（为69.0%）（χ2=5.54，P=0.011）；低、高表达组的5年PFS分别为32.2%和53.4%，差异有统计学意义（χ2=4.30，P= 0.038），见图2。依据治疗方案分层分析显示，接受CHOP方案和R-CHOP方案的患者5年OS分别是52.8% 和67.3%（χ2=5.31，P=0.018）。HDAC6表达在治疗方案分层方面仍然与DLBCL患者的总生存率显著相关（P＜0.05），接受CHOP方案患者中HDAC6低、高表达组5年OS分别为38.9%和62.5%，而接受R-CHOP方案患者中HDAC6低、高表达组5年OS分别为40%和76%，见图3。

图2 HDAC6的表达对DLBCL患者预后的影响

3 讨论

IPI是DLBCL患者最经典的预后评价体系，但IPI未能涉及肿瘤的分子生物学指标，即使具有相同IPI评分的患者预后仍有可能存在较大差异。因此国内外学者纷纷致力于寻找与DLBCL预后相关的标志物。由于DLBCL细胞表面的抗原获取相对容易，其作用也成为研究的热点。

图3 HDAC6的表达对接受不同治疗方案DLBCL患者预后的影响

HDAC是DNA复制、转录、修复过程中的调控关键酶之一。HDAC6为HDAC家族中的一员，其基因位于Xp11.23染色体上，主要在肾脏、心脏及肝脏等组织表达。目前，HDAC6由于与肿瘤关系密切而备受广大科研工作者青睐。LEE等[9]研究显示在SKOV3转化的卵巢癌细胞系、MCF-7乳腺癌细胞系和SKBR3乳腺癌细胞系中，HDAC6基因的敲除能不同程度地抑制细胞增殖；动物实验也进一步证实HDAC6特异性的shRNA处理后的SCID小鼠的肿瘤生长明显受抑制，如进一步用野生型的HDAC6重构HDAC6敲除的小鼠，能重新获得最初的表型。由此可见，HDAC6在肿瘤的生长过程中扮演着极其重要的角色，可能会成为治疗肿瘤的重要分子靶点。

目前研究结果显示，HDAC6在口腔鳞癌、前列腺癌、肺癌、乳腺癌以及多发性骨髓瘤等均呈高表达，且HDAC6的表达与肿瘤的大小、恶性程度和转移密切相关[10-13]。然而有关HDAC6在DLBCL中的表达情况以及与临床病理特征和预后的相关性报道甚少。MARQUARD等[14]研究表明HDAC6在31例DLBCL患者中存在异常表达，HDAC6表达率高达71%，而且HDAC6低表达患者可能预后不良。本研究结果显示在DLBCL患者中有69.9%呈高表达HDAC6，与文献报道基本一致，而高表达HDAC6的DLBCL患者IPI评分为3～5、LDH升高和β2-微球蛋白值升高比例均显著低于低表达患者，因此本研究提示DLBCL患者存在HDAC6的异常表达，而高表达组患者有IPI评分低和肿瘤负荷轻的特点。本研究通过生存分析发现HDAC6高表达组的5年0S和PFS均显著高于低表达组。众所周知，R-CHOP方案治疗DLBCL的疗效和预后远远高于接受CHOP方案治疗的患者，而本研究同样显示接受R-CHOP方案治疗的DLBCL患者的预后较好。为了排除治疗方案对预后的干扰，我们对治疗方案进行分层分析，结果显示，在不同治疗方案的情况下，HDAC6高表达组总生存率均显著高于低表达组。以上结果高度提示HDAC6的表达可能是DLBCL患者的独立的良好预后因素。

综上所述，HDAC6在DLBCL患者中呈高表达，而HDAC6的高表达是DLBCL患者的良好预后因素。因而我们可以通过对HDAC6的表达分析为DLBCL患者提供更准确的预后判断。

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（本文编辑：吴彬）

Expression of histone deacetylase 6 in diffuse large B-cell lymphoma and its clinical significance

LIN Xiaoji, QIAN Zijun, NI Libin, SUN Ni, ZHOU Xiaohai, TONG Huanhuan, ZHOU Shuping, YAO Rongxin. Department of Hematology, the Second Affi liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027

Objective:To explore the histone deacetylase 6 (HDAC6) expression in diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) and to analyze its relationship with the clinicopathological characteristics and survival.Methods:The clinical data from 93 DLBCL patients and 15 patients with reactive hyperplasia of lymph node who were treated in the Second Affi liated Hospital of Wenzhou Medical University from December 2007 to September 2015 was retrospectively analyzed. Cases were subjected to immunohistochemical staining for HDAC6 protein expression in the DLBCL tissue. SPSS was used to analyze the relationship between HDAC6 expression and various clinical factors, and the relationship between HDAC6 and survival.Results:High expression rates of HDAC6 protein in 93 DLBCL tissues were 69.9%, which was signifi cantly higher than 20% in reactive hyperplasia of lymph node (P＜0.05). In DLBLC, the ratio of IPI (0-2) in high expression group was signifi cantly higher than that in low expression group but the ratio of increased LDH and β2-microglobulin in high expression group was signifi cantly lower than that in low expression group (P＜0.05). On Kaplan-Meier analysis, the 5-year overall survival and the 5-year progression free survival in high expression group was signifi cantly higher than that in the low expression one.Conclusion:HDAC6 is highly expressed in DLBCL patients, patients with highly expressed HDAC6 represents low IPI score and light tumor burden. The highly expressed HDAC6 as a favorable prognostic factor has more prognostic value for DLBCL.

diffuse large B-cell lymphoma; histone deacetylase 6; prognosis

R557

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.06.007

2016-07-01

温州市科技局科研基金资助项目（Y20130205）。

林晓骥（1983-），男，浙江温州人，主治医师。

姚荣欣，主任医师，硕士生导师，Email：yaorx0821@ 163.com。