胶质瘤中间质细胞衍生因子-1及神经生长因子的表达及临床意义

张旭标 林涛 曾永亲 郑定容

胶质瘤中间质细胞衍生因子-1及神经生长因子的表达及临床意义

张旭标 林涛 曾永亲 郑定容

目的 探讨间质细胞衍生因子-1(SDF-1)及神经生长因子(NGF)在胶质瘤中的表达及临床意义。方法 收集手术切除的人脑胶质瘤病理标本86例为观察组，其中观察组按不同病理级别分为Ⅰ级15例为Ⅰ组，Ⅱ级24例为Ⅱ组，Ⅲ级26例为Ⅲ组，Ⅳ级21例为Ⅳ组，同期随机选择颅脑外伤患者正常脑组织标本84例为对照组，2组组织均使用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)技术检测SDF-1与NGF mRNA，同时采用免疫组化法检测2组组织中SDF-1与NGF蛋白的表达情况。比较2组组织中SDF-1与NGF mRNA及蛋白表达情况。结果 观察组SDF-1与NGF mRNA基因表达量及蛋白阳性率均高于对照组(P<0.05)；Ⅳ组SDF-1与NGF mRNA基因表达量及蛋白阳性率均高于Ⅲ组；Ⅲ组SDF-1与NGF mRNA基因表达量及蛋白阳性率均高于Ⅱ组；Ⅱ组SDF-1与NGF mRNA基因表达量及蛋白阳性率均高于Ⅰ组，胶质瘤组织中SDF-1与NGF mRNA基因表达量及蛋白阳性率随病理级别的增高而增高(P<0.05)；胶质瘤组织中SDF-1 mRNA表达量及蛋白阳性率呈正相关(r=0.95，P<0.05)，NGF mRNA表达量及蛋白阳性率呈正相关(r=0.96，P<0.05)；SDF-1和NGF高表达均是预测胶质瘤预后不良的独立因素(P<0.01)，SDF-1和NGF的高表达与胶质瘤患者整体不良预后显著相关。结论 胶质瘤中SDF-1与NGF高表达对病变进展有一定促进作用，二者与肿瘤的病理级别密切相关，两者相互作用，SDF-1与NGF在胶质瘤的发生发展中扮演重要的角色，有望为胶质瘤的临床检测及治疗提供新思路。

胶质瘤；间质细胞衍生因子-1；神经生长因子；实时荧光定量聚合酶链式反应；免疫组化

胶质瘤是最常见的颅内原发性恶性肿瘤之一，胶质瘤的生长方式为浸润性生长，药物治疗与手术治疗圴预后差，发率非常高，其致残率及致死率均很高[1]。胶质瘤发病原因尚不明确，其病变进展中出现多种蛋白表达失调[2]；间质细胞衍生因子-1(SDF-1)及神经生长因子(NGF)基因及蛋白表达是近年来肿瘤学领域的研究热点之一，有研究认为SDF-1与NGF与多种恶性肿瘤的预后特别是肿瘤的转移有关[3]，通过实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)定量与免疫组化定性技术，探讨SDF-1与NGF基因及其蛋白表达水平与胶质瘤的恶性程度的关系及临床诊断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2012年1月至2015年1月广东三九脑科医院神经外科手术切除的人脑胶质瘤病理标本86例为观察组，男43例，女43例；年龄13～75岁，平均年龄(45.6±12.2)岁；患者术前未接受放化疗等治疗，均无其他肿瘤病史，均排除肝、肾、肺、心脏和血液性疾病，患者均有齐全完整的临床资料，所有病理标本均取出一部分成制作成石蜡切片，通过HE染色后，由病理科组织两名经验丰富病理医生进行双盲镜检读片，按2007版WHO制定的中枢神经系统肿瘤分类标准[4]，对标本进行组织学及病理学分级，其中Ⅰ级15例为Ⅰ组，Ⅱ级24例为Ⅱ组，Ⅲ级26例为Ⅲ组，Ⅳ级21例为Ⅳ组，同期随机选择颅脑外伤后行颅内减压患者的手术中切取正常脑组织标本84例为对照组，男42例，女42例；年龄12～76岁，平均年龄(46.2±11.9)岁。2组年龄和性别比差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法 观察组患者组织标本为外科手术切取的脑胶质瘤标本，对照组患者组织标本为颅脑外伤手术切除的正常脑组织标本。2组均在术中各取2份标本，其中一份标本通过甲醛固处理备用，另外一份标本通过液氮固定处理备用。

1.2.1 免疫组化法检测:SDF-1和NGF表达检测：SDF-1和NGF表达的检测采用采用免疫组化SP法，步骤均严格按照试剂盒的说明书进行操作。结果标准判定：所有的免疫组化SP切片均由两位病理学主治医师以上的医师对的染色结果进行评定，在高倍镜下(400倍) 随机抽取5个视野，判断标准参照隋锐等[5]的计数方法计算阳性细胞率，阴性：比率<5%；弱阳性：比率5%～25%；阳性：比率26%～50%；强阳性>51%。总阳性率：弱阳性率+阳性率+强阳性率。见图1。

图1 免疫组化SDF-1和NGF 蛋白在胶质瘤组织中表达情况(×400)

A:正常对照脑组织；B: 免疫组化SDF-1和NGF 蛋白低度表达；C: 免疫组化SDF-1和NGF 蛋白中度表达；D: 免疫组化SDF-1和NGF 蛋白高度表达

1.2.2 RT-PCR定量检测:PCR引物序列：参照Tsuyoshi等[6]方法设计正反及探针义链，内参基因为甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)均由FAM标记，由广州中山大学达安基因有限公司合成，与设计的目的片段大小一致。各组份的检测所需的标本均采用液氮固定处理的标本，并按照试剂盒说明进行SDF-1与NGF的RNA萃取，RT-PCR方法获得cDNA片段，基因分析采用美国MJR Option(2) 实时荧光FQ-PCR分仪自带的基因分析应用软件及Gen Bank对比分析基因序列同源性，RNA表达量与内参基因的比值表示 mRNA的相对表达量。见表1。

表1 引物与探针序列

2 结果

2.1 2组患者SDF-1与NGF mRNA基因表达量及蛋白阳性率比较 观察组SDF-1与NGF mRNA基因表达量及蛋白阳性率均高于对照组(P<0.05)。见表2。

表2 2组患者组织SDF-1与NGF mRNA基因表达量及蛋白阳性率比较

2.2 胶质瘤各组mRNA基因表达量及蛋白阳性率比较 Ⅳ组SDF-1与NGF mRNA基因表达量及蛋白阳性率均高于Ⅲ组；Ⅲ组SDF-1与NGF mRNA基因表达量及蛋白阳性率均高于Ⅱ组；Ⅱ组SDF-1与NGF mRNA基因表达量及蛋白阳性率均高于Ⅰ组，胶质瘤组织中SDF-1与NGF mRNA基因表达量及蛋白阳性率随病理级别的增高而增高(P<0.05)；SDF-1 mRNA表达量与NGF mRNA表达量呈正相关(r=0.86，P<0.05)。见表3。

表3 SDF-1与NGF mRNA基因表达量及蛋白阳性率在TNM分期表达比较

2.3 SDF-1和NGF预后相关性分析 SDF-1和NGF高表达均是预测胶质瘤预后不良的独立因素(P<0.01)，SDF-1和NGF的高表达与胶质瘤患者整体不良预后显著相关。见表4、5。

WHO分级SDF⁃1高表达例生存期(月)SDF⁃1低表达例生存期(月)NGF高表达例生存期(月)NGF低表达例生存期(月)Ⅰ～Ⅱ1828．8±6．71139．4±7．91727．6±8．61240．6±8．5Ⅲ～Ⅳ2011．6±4．42718．8±6．82210．5±3．72520．5±7．3t值35．641．331．345．2P值<0．01<0．01<0．01<0．01

表5 SDF-1和NGF mRNA表达量风险级别分析

3 讨论

神经胶质瘤是一种起源于胶质细胞的最常见的颅内原发性中枢神经系统肿瘤，约占颅内肿瘤50%，发病率居脑原发性恶性肿瘤首位[7]，呈浸润性生长，常侵犯大脑的重要解剖和功能区域，难以治愈。目前，对神经胶质细胞瘤诊断及病情变化的判断主要依靠主要依赖影像学检查及术后病理诊断，但依然存在一定局限性，缺乏具有指导意义的肿瘤标记物，尽管近年来报到了许多与神经胶质细胞瘤相关的蛋白及因子，但关于这些蛋白对神经胶质细胞瘤诊断及预后的提示作用至今尚未达成共识[8]。

SDF-1是来源于骨髓基质细胞及其他相关的上皮细胞和间皮细胞所分泌的具有特殊化学诱导作用的生物因子，其产生与炎性反应无直接相关，是趋化因子 家族成员之一，参与肿瘤细胞趋化性、血管生成及肿瘤转移的功能，有研究表明，SDF-1在多种肿瘤中均有表达，参与了肿瘤细胞的侵袭、转移[9]。NGF存在于中枢神经系统内的海马、脑干和大脑皮质中的神经元及胶质细胞之中，受体酪氨酸激酶 (Trk)家族和NGF家族呈高度特异性亲和合，特别是 TrkA和NGF高度相结合[10]，NGF是神经系统重要的营养因子，是多功能性生长因子，对神经元与前体细胞发挥着促进生长、分化、再生与修复等重要作用[11]。本研究通过观察SDF-1和NGF在胶质瘤的恶性程度的关系，为胶质瘤的临床检测及治疗提供理论依据和新思路。

本研究结果表明，SDF-1和NGF在胶质瘤中的表达明显高于正常脑组织中的表达，这提示胶质瘤在生长过程中，由于胶质瘤细胞的自我分泌作用，进入脑组织中，胶质瘤本身刺激其周围的神经胶质细胞分泌SDF-1和NGF所致；胚胎发 育时期，脑组织中NGF mRNA表达量与胆碱能神经元中乙酰胆碱转移酶的活性呈正相关，成年后消失，脑组织中神经损伤后NGF又重新大量表达[11]。肿瘤的发生是一个多因素参与、多基因突变、多步骤、多阶段进展的复杂事件，本研究发现NGF与SDF-1的表达从正常组到胶质瘤Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级组逐渐增高，且差异均有显著性； SDF-1是表达于脑组织中的趋化因子之一，在正常的脑组织中，维持较低的生物水平，不发挥迁移及趋化的作用，主要是由星形胶质细胞和神经元表达，当脑组织发生低氧、缺血和炎症等病变后，SDF-1高度表达，趋化免疫系统的单核细胞—巨噬细胞向受损脑组织迁移并发挥相应的免疫生物学效应，SDF-1能够激活机体的ERK-1/2和Akt信号通路，调节抗凋亡信号途径促进细胞增殖。NGF是神经系统重要的营养因子之一，NGF是促进神经系统发育的必须因子，具有多功能性生长因子，其表达主要在神经系统，不仅可促进神经的生长和分化，而且对免疫和炎症细胞具有确切的趋化和增殖活性，王向鹏等[12]研究表明，NGF在胶质瘤的发生和增殖过程中，除了胶质肿瘤细胞自身分泌还激活海马和皮质等部位合成和释放NGF。胶质肿瘤脑组织中NGF与SDF-1表达水平相关性分析结果表明，脑组织中SDF-1 mRNA表达量与NGF mRNA表达量呈正相关，SDF-1和NGF的表达与胶质瘤患者整体不良预后密切相关，NGF与SDF-1间的相互作用是影响胶质瘤细胞生长的重要因素，提示NGF与SDF-1相互协调促进神经胶质瘤的发生，共同参与了神经胶质瘤的发生、发展、转移及浸润，胶质瘤细胞是一个复杂的细胞学和生物化学对损伤与再生的反应性调控过程，当损伤刺激后NGF与SDF-1即逆转为高表达状态。本试验的结果可以看出NGF与SDF-1在脑胶质瘤中的表达风险级别回归分析，NGF与SDF-1的表达水平与患者的年龄、性别和肿瘤的大小无明显关系，而与胶质肿瘤的分化程度有密切关系，提示NGF与SDF-1的高表达是胶质肿瘤发生的重要的危险因素之一，NGF与SDF-1共同协同作用，在促进胶质肿瘤的发生、发展、转移及浸润中可发挥重要作用。

综上所述 ，胶质瘤中SDF-1与NGF高表达对病变进展有一定促进作用，二者与肿瘤的病理级别密切相关，两者相互作用，SDF-1与NGF在胶质瘤的发生发展中扮演重要的角色，有望为胶质瘤的临床检测及治疗提供新思路。

1 Kawarazaki S,Taniguchi K,Shirahata M,et al.Conversion of a molecular classifier obtained by gene expression profiling into a classifier basedon real-time PCR:a prognosis predictor for gliomas.BMC Med Genom,2010,3:1755-1767.

2 贾巍.胶质瘤中原癌基因转酮醇酶1和组织蛋白酶D的表达及临床意义.实用医学杂志2014,30:2792-2794.

3 韩东,宋伟,夏国庆,等.NGF在人脑胶质瘤中的表达与临床意义.河南科技大学学报(医学版),2015,33:257-258.

4 占传家,朱文珍,王承缘.2007年世界卫生组织对于中枢神经系统肿瘤的分类.放射学实践,2008,23:122-127.

5 隋锐,张烨,陈一,等.MMP-2及VEGF在脑胶质瘤中的表达及其临床意义.华南国防医学杂志,2014,28:443-444.

6 Tsuyoshi K,Norio O,Tsutomu Y,et al.Genotyping analysis of Mycoplasma pneumoniae clinical strains in Japan between 1995 and 2005:type shift phenomenon of M．pneumoniae clinical strains．Medical Microbiology，2008,57:469-475.

7 刘玉翠,杨阳,金嵩,等.双氢青蒿素抗恶性脑胶质瘤作用的研究.吉林医药学院学报,2016,37:23-25.

8 丁春辉,刘玉光.脑神经胶质细胞瘤和脑膜瘤患者血清IGFBP-2水平测定及临床意义.中国现代医生,2011,49:51-52.

9 Heinrich EL,Lee W,Lu J,et al.Chemokine CXCL12 activates dual CXCR4 and CXCR7-mediated signaling pathways in pancreatic cancer cells.Journal of Translational Medicine,2012,10:68．

10 Manns MP,Czaja AJ,Gorham JD,et al.Diagnosis and management of autoimmune hepatitis.Hepatology,2010,51:2193-2213．

11 刁正文,李平,耿保伟,等.神经生长因子在胶质瘤中的表达与意义.泸州医学院学报,2009,32:627-631.

12 王向鹏,杨智勇,王廷华,等.神经生长因子和脑源性神经营养因子在脑胶质瘤内的表达.国际神经病学神经外科学杂志,2006,33:99-102.

Expression and clinical significance of stromal cell-derived factor-1 and nerve growth factor in gliomas

ZHANGXubiao,LINTao,ZENGYongqin,etal.

DepartmentofNeurosurgery,Guangdong999BrainHospital,Guangzhou510510,China

Objective To investigate the expression and clinical significance of stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) and nerve growth factor (NGF) in gliomas.Methods Eighty-six pathological specimens of human brain glioma that were collected in our hospital from January 2012 to February 2016 were enrolled as observation group,moreover,which was redivided into 4 subgroups according to different pathological grade,including 15 cases in grade Ⅰ group,24 cases in grade Ⅱ group,26 cases in grade Ⅲ group,21 cases in grade Ⅳ group,moreover,the other 84 cases of brain tissue specimens of patients with craniocerebral trauma were seclected as control group. The expression levels of SDF-1 and NGF mRNA were detected by Real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-PCR), at the same time,the expression levels of SDF-1 and NGF protein were detected by immunohistochemistry.Results The expression levels of SDF-1 and NGF mRNA gene and protein in observation group were significantly higher than those in control group (P<0.05).The expression levels of SDF-1 gene,NGF mRNA and protein in grade Ⅳ group were significantly higher than those in grade Ⅲ group,which in grade Ⅲ group were significantly higher than those in grade Ⅱ group, moreover, which in grade Ⅱ group were significantly higher than those in grade Ⅰ group, besides,the expression levels of SDF-1, NGF mRNA gene and protein in glioma were increased with the increase of pathological grade (P<0.05). Moreover the expression levels of SDF-1 mRNA in gliomas were positively correlated to positive rates of protein (r=0.95,P<0.05),and the expression levels of NGF mRNA were positively correlated to positive rates of protein (r=0.96,P<0.05).Moreover the high expression of SDF-1 NGF was independent factors to predict poor prognosis of glioma (P<0.01),and the high expression of SDF-1 NGF was closely correlated to whole poor prognosis of patients with glioma.Conclusion The high expression of SDF-1 and NGF in gliomas has a certain role in promoting progression of disease,both of them are closely correlated with pathological grade,thus,both factors play an important role in pathogenesis and development of glioma,it is expected to provide new ideas for clinical detection and treatment of glioma.

glioma; stromal cell-derived factor-1; nerve growth factor; real-time quantitative polymerase chain reaction; immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.15.002

510510 广州市，广东三九脑科医院神经外科(张旭标、林涛、曾永亲);广东省深圳市宝安区中心医院社区健康服务管理中心(郑定容)

R 338.15

A

1002-7386(2017)15-2250-04

2016-11-12)