参元丹胶囊对动脉粥样硬化小鼠主动脉斑块的干预作用及胰岛素抵抗标志蛋白GLUT-4的影响

张颖 周明学 李思耐 任攀 刘卫红 尚菊菊 刘红旭



·论著·

参元丹胶囊对动脉粥样硬化小鼠主动脉斑块的干预作用及胰岛素抵抗标志蛋白GLUT-4的影响

张颖 周明学 李思耐 任攀 刘卫红 尚菊菊 刘红旭

目的 参元丹胶囊对动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)小鼠主动脉斑块的干预作用及胰岛素抵抗标志蛋白葡萄糖转运蛋白-4(glucose transport protein-4，GLUT-4)的影响。方法 将50只8周龄雄性ApoE-/-小鼠西方类型膳食喂养6周后随机分为模型组、立普妥(阳性对照组)、参元丹高剂量组、中剂量组和低剂量组(n=10)，给予药物腹腔注射6周。检测其血清总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、血清游离脂肪酸、空腹血糖和空腹血清胰岛素水平。行苏木素-伊红染色(hematoxylin and eosin staining, HE)，图像分析测量小鼠主动脉AS斑块面积。免疫组化法检测各组小鼠主动AS斑块内GLUT-4的表达。结果 与模型组相比，参元丹胶囊中剂量组小鼠血清TC水平明显降低(P<0.01)、参元丹胶囊中、低剂量组小鼠血清TG水平明显降低(P<0.05)、参元丹胶囊3个剂量组LDL-C水平明显降低(P<0.05，)，参元丹胶囊中、低剂量组HDL-C水平明显升高(P<0.05)，参元丹胶囊3个剂量组小鼠动脉粥样硬化指数显著降低(P<0.05)，高、中、低剂量组小鼠血清游离脂肪酸浓度显著降低(P<0.05)。参元丹胶囊3个剂量组小鼠空腹血糖水平无显著差异(P>0.05)，血清胰岛素水平显著降低(P<0.05)，中剂量组胰岛素抵抗指数显著降低(P<0.01)。与模型组相比，参元丹胶囊中、高剂量组小鼠主动脉斑块内GLUT-4表达显著升高(P<0.05)。结论 参元丹胶囊可能通过调控GLUT-4表达改善胰岛素抵抗，从而达到抗AS的作用。

动脉粥样硬化； 参元丹胶囊； 血脂异常； 胰岛素抵抗； 葡萄糖转运蛋白-4

胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)是多种代谢性心脑血管疾病的共同致病基础，是动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)性心血管疾病发生、发展的危险因素之一。大量研究表明：IR可导致血管内皮细胞损伤、平滑肌细胞增殖、炎症反应加强及脂质代谢紊乱，从而促进AS的发生和进展[1]。参元丹胶囊为北京中医医院研制的院内制剂，是根据冠心病心绞痛气虚血瘀证的临床特点，基于中医络病理论，以益气逐瘀法为组方原则的经验方剂。既往研究表明参元丹胶囊具有保护缺血心肌抗心肌脂质过氧化、保护缺血再灌注损伤、防止心肌细胞发生凋亡和自噬等药理作用[2-6]，但其是否可通过改善IR起到抗AS的作用尚未见相关报道。因此，本实验拟采用西方类型膳食喂养的载脂蛋白E基因敲除小鼠(apolipoprotein Eknocknout，ApoE-/-)为AS小鼠模型，研究参元丹胶囊对AS小鼠动脉粥样硬化指数、IR指数和IR标志性蛋白葡萄糖转运蛋白-4(glucose transport protein-4，GLUT-4)表达的影响。

1 材料

1.1 实验试剂和仪器

血清总胆固醇(total cholesterol，TC)检测试剂盒(批号7007210506)、血清甘油三酯(triglyceride,TG)检测试剂盒(批号7006210506)、血清低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)检测试剂盒(批号7021220605)、血清高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)检测试剂盒(批号7020210506)和小鼠血清血糖试剂盒(批号7026210504)，均购自英科新创(厦门)科技有限公司。小鼠血清游离脂肪酸试剂盒(批号C06610101)购于英国朗道公司。小鼠血清胰岛素试剂盒(货号CK-E00728M)购于美国R&D公司。血生化指标检测采用日本奥林巴斯株式会社全自动生化仪(AU480)。美国Image-ProPlus Version 5.0(IPP) 图像分析软件。

1.2 实验药物

阿托伐他汀钙，商品名立普妥，上海辉瑞制药公司，批号H20051408。参元丹胶囊，批号Z20053327。

1.3 动物及分组

6～8周龄ApoE-/-小鼠(品系C57BL/6J)，8周龄，体重18～20 g，购自北京维通利华实验技术有限公司，50只，高脂饲养6周后，所有小鼠随机分为模型组、立普妥组(阳性对照组)3.34 mg/kg、参元丹胶囊高剂量组160 mg/kg、中剂量组80 mg/kg和低剂量组40 mg/kg，每组10只。参元丹胶囊高剂量、中剂量和低剂量分别选取临床常用剂量的2倍、临床剂量和临床常用剂量的1/2，并按成人与小鼠的给药剂量换算系数折算成小鼠用量灌胃给药[7]，每日1次，灌胃给药6周。模型组给予等量的生理盐水。高脂饲料配方为脂肪21%(wt/wt)、胆固醇0.15%的西方类型膳食饲料[8]。各组动物在喂养12周后，颈椎脱臼法处死，眶下静脉丛取血，保留血清，无菌条件下取心脏，心脏用4%多聚甲醛固定。

1.4 血脂检测

采用氧化酶法和直接法检测参元丹胶囊对高脂喂养12周ApoE-/-小鼠血清TC、TG、LDL-C和HDL-C水平。动脉粥样硬化指数(atherosclerosis index，AI)= (TC-HDL-C)/HDL-C。

1.5 血清游离脂肪酸、空腹血糖和血清胰岛素水平检测

采用比色法检测小鼠血清游离脂肪酸(nonesterified fatty acid，NEFA)水平，采用氧化酶法检测小鼠血清空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)水平，采用ELISA法检测小鼠空腹血清胰岛素(fasting insulin，FIns)水平。胰岛素抵抗指数(HOMA insulin resistance index,HOMA-IR)=(FBG×FIns )/22.5，HOMA-IR>2.7为胰岛素抵抗模型制作成功[9]。

1.6 组织病理

小鼠心底部横断面连续切片，每隔50 μm连续取6张切片，切片厚5 μm。按Suzuki等[10]确立的方法，主动脉根部以主动脉瓣为标志选取4个切面，分别为：(1)升主动脉最近端横截面，切面形态呈圆形；(2)主动脉瓣起始横截面；(3)主动脉瓣附着部位，并有冠状动脉开口；(4)主动脉瓣完全出现并汇合在一起。在实验中统一选取第三切面，做病理HE染色。IPP图像软件分析测量小鼠主动脉AS斑块面积，具体如下：

测量管腔面积(lumen area，LA)、内弹力膜围绕面积 (internal elastic laminal area，IELa)，并计算斑块面积、校正后斑块面积。公式换算如下：斑块面积(plaque area，PA)(mm2)=IELa-LA；校正后斑块面积=PA/IELa。

1.7 免疫组化法检测

免疫组化染色选取第三切面，采用两步法测定斑块内GLUT-4表达(抗体稀释度为1∶100)，每组均以PBS 代替一抗作为阴性对照，在100 倍镜下每张切片选取5个不同的视野，对阳性区域累积面积进行定量测定，最后求取斑块内阳性区域面积占斑块面积的百分比。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 小鼠动脉粥样硬化模型的建立

高脂喂养12周后，ApoE-/-小鼠主动脉出现典型的AS斑块，其主动脉管壁上可观察到典型的富含胆固醇结晶和胆固醇酯的AS斑块，斑块有成熟的纤维帽覆盖(图1B，黑箭头所示)，斑块内及血管外面有大量炎性细胞，主动脉中层结构被破坏，说明复制小鼠AS模型建立成功。

注：A为高脂喂养12周ApoE-/-小鼠主动脉根部病理形态HE染色图(×100)；B为A图的局部放大，黑箭头指示主动脉壁AS斑块(×200)。

图1 高脂喂养12周ApoE-/-小鼠主动脉根部动脉粥样硬化模型的建立

2.2 参元丹胶囊对高脂喂养12周ApoE-/-小鼠血脂和动脉粥样硬化指数的影响

小鼠灌胃6周后，与模型组相比，参元丹中剂量组小鼠血清TC水平明显降低(P=0.002)，参元丹胶囊中、低剂量组小鼠血清TG 水平明显降低(P=0.002，P=0.006)、参元丹胶囊高、中、低3个剂量组LDL-C水平均明显降低(P=0.017，P=0.001，P=0.012)，参元丹胶囊中、低剂量组HDL-C水平明显升高(P=0.004，P=0.001 )，参元丹胶囊高、中、低3个剂量组小鼠AI显著降低(P=0.0005，P=0.0004，P=0.0003)，与阳性对照立普妥组相比，参元丹胶囊高剂量和低剂量组小鼠血脂各指标和AI均无显著差异(P>0.05)。见表1。

2.3 参元丹胶囊对高脂喂养12周ApoE-/-小鼠主动脉斑块面积的影响

药物干预6周后，经HE染色和IPP图像软件分析结果显示：与模型组相比，参元丹胶囊高、中、低三个剂量组小鼠的校正后主动脉AS斑块面积显著降低(P=0.00001，P=0.00002，P=0.00005)，与阳性对照立普妥组之间无显著差异(P>0.05)。见图2、表2。

表1 各组动脉粥样硬化小鼠血脂水平和AI的比较±s)

注： 与模型组相比，aP<0.05。

注：黑箭头指示AS斑块。

图2 各组动脉粥样硬化小鼠主动脉AS斑块面积的比较(HE染色，×200)

注：黑箭头指示AS斑块。

图3 各组动脉粥样硬化小鼠主动脉AS斑块内GLUT-4表达比较(HE染色，×200)

表2 各组动脉粥样硬化小鼠主动脉斑块面积及GLUT-4表达的比较

注： 与模型组相比，aP<0.05。

2.4 参元丹胶囊对高脂喂养12周ApoE-/-小鼠主动脉斑块内GLUT-4表达的影响

药物干预6周后，免疫组化结果显示：与模型组相比，立普妥组和参元丹胶囊中剂量和高剂量组小鼠主动脉斑块内GLUT-4表达面积百分比明显增多(P=0.0003，P=0.0002)，参元丹胶囊中剂量组和高剂量组与阳性对照药立普妥组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2、图3。

2.5 参元丹胶囊对高脂喂养12周ApoE-/-小鼠NEFA、FBG、FIns和HOMA-IR的影响

药物干预6周后，与模型组相比，参元丹胶囊高、中、低三个剂量组小鼠NEFA水平显著降低(P=0.0005，P=0.0004，P=0.0006)，FBG水平均无显著改变(P>0.05)，FIns水平显著降低(P=0.0003，P=0.0002，P=0.0002)，参元丹胶囊中剂量组HOMA-IR显著降低(P=0.004)。与阳性对照药立普妥组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

3 讨论

IR可通过促进血管内皮细胞损伤、平滑肌细胞增殖、炎症反应及脂质代谢紊乱，从而促进AS的发生和进展[1]。既往研究发现参元丹胶囊具有保护缺血心肌、抗心肌脂质过氧化、保护缺血再灌注损伤、防止心肌细胞发生凋亡和自噬等药理作用[2-6]，但其是否可通过改善IR起到抗AS的作用尚未见相关报道。

表3 各组动脉粥样硬化小鼠NEFA、FBG、FIns、HOMA-IR的比较

注： 与模型组相比，aP<0.05。

参元丹胶囊是国家中医心血管病重点专科学科带头人、北京中医医院心血管科刘红旭主任研制的院内制剂，根据冠心病心绞痛气虚血瘀证的临床特点，基于中医络病理论，以益气逐瘀法为组方原则的经验方剂。在重用黄芪、党参益气扶正的基础上，选用水蛭、土鳖虫破血逐瘀，并配以玄参、丹参、地龙、延胡索。从络病论治理论来看，方中水蛭、土鳖虫、地龙均为虫蚁之类，藉其“蠕动之物可以松透病根”而直入络分幽微之所，搜剔血络，透毒外出，则络脉瘀滞瘀毒可除；“邪之所凑，其气必虚”，故又兼顾其络脉空虚，以党参补中益气，黄芪扶助正气，玄参滋而不腻，充养络脉。丹参养血活血，延胡索行气活血止痛，共奏益气逐瘀、行气通络之效[11]。本研究结果表明参元丹胶囊可不同程度改善AS小鼠的血脂水平和动脉粥样硬化指数，以参元丹中剂量组即临床常用剂量治疗效果为优，说明参元丹胶囊具有较好的调整血脂和抗AS作用。

Stern根据IR和AS之间的相关性提出了“共同土壤学说”，认为IR是心脑血管疾病中众多代谢性异常的致病基础和原始动因[12]。IR可通过影响体内C肽及脂联素的水平，导致脂质代谢紊乱及炎症反应的发生，引起AS[13]。本研究结果也表明，参元丹胶囊具有较好的减轻AS小鼠空腹血清胰岛素HOMA-IR的作用，这说明改善IR可能是参元丹胶囊抗AS的作用机制之一。

GLUT-4是一种含509个氨基酸的糖蛋白，主要存在于对胰岛素敏感的骨骼肌、心肌和脂肪组织，是这些组织细胞的主要葡萄糖转运体，破坏小鼠肌肉中Glut4基因可导致IR和葡萄糖耐量减退[14]。GLUT-4是发生IR的标志性蛋白之一。高脂饮食可通过影响胰岛素信号转导通路导致外周IR，如胰岛素受体数目、胰岛素受体底物-1及GLUT-4水平在高脂饮食后均可下降，从而限制了进入细胞内的葡萄糖流量，使得细胞进行糖代谢减少。有研究发现[15]，高脂饮食可下调白色脂肪组织中的GLUT-4mRNA的水平，并明显减弱由胰岛素刺激的脂肪细胞GLUT-4的转位及葡萄糖的摄取。课题组的研究结果表明，参元丹胶囊可明显增加动脉粥样硬化小鼠主动脉斑块内GLUT-4蛋白的表达，提示参元丹胶囊可能通过增加葡萄糖的转运，改善IR，进而发挥抗AS作用。

综上，参元丹胶囊具有较好的调整血脂、减少主动脉斑块面积、降低血清胰岛素和胰岛素指数，并可升高主动脉斑块内GLUT-4表达作用。参元丹胶囊可能通过调控主动脉斑块内GLUT-4表达改善IR，从而达到抗ApoE-/-小鼠主动脉AS的作用，但其具体的作用机制还需深入研究。

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(本文编辑： 董历华)

Effects ofShenyuandancapsule on atherosclerotic plaque and the expression of GLUT-4 in atherosclerotic mice

ZHANGYing，ZHOUMingxue，LISinai，etal.

DepartmentofTCM，BeijingLuheHospital,CapitalMedicalUniversity，Beijing100149，China

LIUHongxu，E-mail：lxh_263.net

Objective To study the effect ofShenyuandancapsule on atherosclerotic plaque and the expressions of insulin resistance marker protein glucose transport protein-4(GLUT-4)in aorta of atherosclerotic mice. Methods Fifty 8 week-old male ApoE-/-mice were fed with a western type diet for 6 weeks, and the rats were randomly divided into control group, Lipitor (positive control group),Shenyuandancapsule (high-dose group, SYDC-H, middle-dose group, SYDC-M，and low-dose group, SYDC-L ), 10 rats in each group, and have been intraperitoneally injected for 6 weeks. The levels of total cholesterol (TC), triglyceride (TG), low density lipoprotein cholesterol (LDL-C), high density lipoprotein cholesterol (HDL-C), serum free fatty acid, fasting blood glucose and fasting insulin levels in serum of ApoE-/-mice were detected. HE staining was used to measure the area of AS plaque in aortic. Immunohistochemical method was used to detect the expression of GLUT-4 in plaques of AS mice. Results Compared with the control group, the TC levels of SYDC-M group were significantly reduced, the TG levels of the mice of SYDC-M group and SYDC-L group were significantly decreased, the LDL-C levels of SYDC-L group，SYDC-M group and SYDC-H group were significantly decreased and the HDL-C levels of SYDC-M group and SYDC-L were significantly increased (P<0.05). The atherosclerosis indexes of SYDC-L group，SYDC-M group and SYDC-H group were decreased significantly (P<0.05). The levels of free fatty acids in serum of SYDC-L group，SYDC-M group and SYDC-H group were significantly decreased (P<0.05). There was no significant difference in fasting plasma glucose level (P>0.05), the insulin level of SYDC-H group, SYDC-M group and SYDC-L group were significantly decreased (P<0.05) and the insulin resistance indexes of SYDC-M group were significantly decreased (P<0.05). Compared with the control group, the expressions of GLUT-4 in the aortic plaques of SYDC-H group and SYDC-M group were significantly increased(P<0.05). ConclusionShenyuandancapsule may be possible to improve the insulin resistance by regulating the expression of GLUT-4, so as to achieve the effect of anti AS.

Atherosclerosis;Shenyuandancapsule; Dyslipidemia; Insulin resistance; Glucose transport protein-4

国家自然科学基金( 81673744)；北京市自然科学基金(7162043)；北京市卫生系统高层次卫生技术人才项目( 2014-3-100)

100149 首都医科大学附属北京潞河医院中医科(张颖)；首都医科大学附属北京中医医院 北京市中医研究所(周明学、李思耐、任攀、刘卫红)，首都医科大学附属北京中医医院中医心内科(刘红旭、尚菊菊)

张颖(1979- ),女，博士，主治医师。研究方向：中西医结合心内科研究。E-mail：zhyxr15@126.com

刘红旭(1963- )，本科，教授。研究方向：心血管疾病的中西医结合研究。E-mail：lxh_263.net

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.07.001

2017-02-22)